黃瓜雌核離體培養(yǎng)加倍技術(shù)

1/6頁(yè)材料與方法

黃瓜雌核離體培育加倍技術(shù)黃瓜未受精子房離體培育體系的建立材料滑型雌性系(長(zhǎng)、短)與中國(guó)刺瘤類(lèi)型的Fl代。方法雌花采集：取未開(kāi)放的黃瓜雌花，去掉花冠和花柄。75%酒精處理子房30秒，然后用10%次氯酸鈣液滅菌15分鐘。用無(wú)菌水沖洗3次。導(dǎo)培育基的三角瓶?jī)?nèi)。1963)培育基根本成分(詳見(jiàn)附表2)為根底，依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)做相應(yīng)調(diào)襤。培育基中的大鼉SIGMANaOH或HCI調(diào)PH至5.8，加熱溶化后分裝至三角瓶，25ml／瓶，在SANYO高壓滅菌器120℃，1.06Kg/cm2的壓力下，滅菌15min。25℃黑暗條件下培育7天，然后移至同等溫度、14hr光／l0hr黑暗條件下培育。3~4周后即可繼代。繼代培育基：1/2MS+BA0.5mg/L+30g/L再生植株的擴(kuò)繁：自未受精子房產(chǎn)生的幼小胚芽，繼代至1／2MS培育基15天后，形成正常小植株(根莖葉完整)，為保護(hù)其種質(zhì)資源，提高種苗基數(shù)，使5cm左右的正常小植株，剪成2-3cm小段，每段含1或2節(jié)，插接于快繁培育基上。快繁培育基K：MS大量、微量、有機(jī)，F(xiàn)eKT/NAA(0.1/0.1mg/L)3-4個(gè)。再生植株馴化與移栽：“一步移栽法”：3-4cm深的蛭石，用除糖和瓊脂的MS根本培育基澆濕，然后封口、高壓滅菌；2片開(kāi)放葉部位下，用剪刀剪下，將枝條直接扦插在廣口玻璃瓶?jī)?nèi)的蛭石上，用薄膜封口，置于組培室架上培育：7天后松開(kāi)瓶口的薄膜。再過(guò)3天去掉薄膜，再過(guò)7天左右即可將苗和瓶移至室內(nèi)5天左右視苗子大小即可移栽到溫室。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，成活率根本到達(dá)l00%，而且馴化過(guò)程格外簡(jiǎn)潔。再生植株的倍性鑒定染色體制片法R5(F1)為供體材料，通過(guò)來(lái)受精子房進(jìn)展離體培育，獲得約200株再生植株，定植于玻璃日光溫室中，取5-6cm長(zhǎng)的幼嫩卷須為試材，供倍性鑒定爭(zhēng)論。方法：染色體制片方法以陳瑞陽(yáng)等(1981)的去壁低滲法為根本方法，針對(duì)黃瓜的具體狀況對(duì)采樣時(shí)間預(yù)處理酶解去壁等環(huán)節(jié)進(jìn)展優(yōu)化最終確定染色體制片步驟如下：i 預(yù)處理取再生植株幼嫩卷須用0.1%秋水仙堿+0.002M8-羥基喹啉溶液處理2小時(shí)。ii 前低滲：將卷須轉(zhuǎn)入0.075mo1/LKCL低滲液中，在20~25℃條件下處理30min。iii 前固定：倒去KCL溶液，用甲醇-冰乙酸(3:1)于0~5℃條件下固定40min。1%混合酶液(纖維酶和果膠酶各占1%)在25℃溫箱內(nèi)處理50min。后低滲：倒去酶液，用蒸餾水沖洗2-3次，轉(zhuǎn)入蒸餾水中后低滲10-15min。后固定：再用配制甲醇-冰乙酸(3:1)固定30min以上?？菰?。Giemsa染色。鏡檢：①染色體計(jì)數(shù)：用OPTON911型顯微鏡觀看。②染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目：在OlympusIX70顯微鏡下(400X)觀看并測(cè)量染20個(gè)，求其平均值。染色中心直徑的觀測(cè)值乘以1.667調(diào)整為實(shí)際值。進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。葉片氣孔直徑和保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目測(cè)定法條件下，測(cè)量氣孔直徑大小。每基因型植株取l0片葉進(jìn)展計(jì)數(shù)和測(cè)量并求其平均植。氣孔直徑的觀測(cè)值乘以1.667調(diào)整為實(shí)際值。進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞按DNA熒光染色法肉細(xì)胞游離，然后參加DN特異性熒光染料DAPI二鹽酸-，6二脒基-2苯基吲哚，5μg/m1)1滴并與葉肉細(xì)胞混勻，然后在紫外光(λ=490nm)下，用Univer掃描顯微分光光樣品測(cè)量20個(gè)細(xì)胞核，計(jì)算平均值。植株形態(tài)觀看工程包括葉片外形，花的外形，花粉發(fā)育，果實(shí)形態(tài)，種子育性等。黃瓜染色體加倍爭(zhēng)論HM6、HM36、HM45、HM82、H-71等，雙單倍體植株H4-1進(jìn)展染色體加倍試驗(yàn)。生長(zhǎng)點(diǎn)浸泡、扦插法選用不同基因型的單倍體植株，用0.5%、1%的秋水仙堿分別浸泡其生長(zhǎng)點(diǎn)2h、4h后，扦插于含有養(yǎng)分液的蛭石中，成活后定植于溫室，鑒定其倍性變化。生長(zhǎng)點(diǎn)涂抹處理和浸泡處理0.2%和0.5%秋水仙素掛瓶浸泡法對(duì)剝?nèi)∩L(zhǎng)點(diǎn)后的單倍體植株進(jìn)展浸泡處理，從9:00~16:00浸生長(zhǎng)點(diǎn)7h。雙單倍體幼苗加倍試驗(yàn)倍處理：0.2%秋水仙素；0.2%秋水仙素+1.5%DMSO；0.05%、0.1%、0.2%氟樂(lè)靈在每天8:00和18:00滴于生長(zhǎng)點(diǎn)，連續(xù)處理5天。一次。株數(shù)、變異株數(shù)、加倍株數(shù)，計(jì)算成株率、變異率(變異株占處理株數(shù)的百分比)、加倍率(加倍株占處理株數(shù)的百分比)。黃瓜離體雌核發(fā)育的過(guò)程及其早期生化變化爭(zhēng)論材料、培育基和培育方法選用31-2d2-3mm厚的下。石蠟切片觀看0d、3d、6d、12d、24d、36d取培育的子房切片，承受連續(xù)石蠟切片法，愛(ài)氏蘇木精染色，用Olympus相差顯微鏡觀看并照相。方法步驟：后保存于70%的乙醇(4℃)中備用；采集春三、雜二、P66、4、1、3、A16黃瓜品種距開(kāi)花前一天的未受粉子房，無(wú)菌條件下，將子房分割成5mm長(zhǎng)的小圓塊，進(jìn)展接種，分別培育在Mo67、W5、M99、M100培育基中，取培育不同天數(shù)的未受粉子房，分別固定于FAA液中，固定時(shí)間>2h，后保存于70%的乙醇(4℃)中備用。70%→85%→95%→100%濃度梯度的乙醇及→60min，其中二甲苯中脫水時(shí)間視透亮程度而定。1/2的60℃石蠟、二甲苯混合后，于60℃烤箱中化蠟，將材料進(jìn)展浸蠟，然后進(jìn)展橫、縱兩種方向包埋。切片：將包埋好蠟塊依據(jù)橫、縱兩種方向進(jìn)展切片厚度為9~11μm。切片脫蠟、染色：將切片分別轉(zhuǎn)入二甲苯→1/2無(wú)水乙醇、二甲苯的混合液及100%→95%→85%→70%→50%濃度梯度的乙醇中脫蠟，其中在二甲苯、1/2無(wú)水乙醇、二甲苯的混合液中放置30min，其余濃度梯度乙醇中放置3~5min，然后轉(zhuǎn)入蒸餾水中后用愛(ài)60min50→70→85→95→100%1/2二甲苯、無(wú)水乙醇的混合液→二甲苯中，放置時(shí)間同下行時(shí)間。封片：最終用加拿大膠封片，供觀看照相。酶活性測(cè)定0d、3d、6d、取培育在M99和W5培育基上的子房外植體，先用蒸餾水洗凈，吸干外表水，再用塑料膜小袋包裝后快速置于-80℃保存?zhèn)溆?。過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測(cè)定：酶液的提取按《現(xiàn)代植試驗(yàn)指南》(中國(guó)科學(xué)院上海植物生理爭(zhēng)論所，1999)的方法。POD活性承受張志良(1990)的方法測(cè)定，以1min △0D470表示1個(gè)酶活性單位。SOD活性承受《現(xiàn)代植(中國(guó)科學(xué)院上海植物生理爭(zhēng)論所，1999)的方法測(cè)定，以NBT的光SOD抑制50%時(shí)參加的酶量(ml)為1個(gè)酶活性單位。酶和Ca2+-ATP酶活性測(cè)定：依照李楊瑞(1987)的方法。Q酶活性測(cè)定：依照李太貴、沈波等(1997)的方法。激素含量測(cè)定-80IAA，iPA，Zr，ABA，GA3及GA4的測(cè)定按何鐘佩編(1993)方法進(jìn)展。可涪性蛋白食量及POD、EST同工酶可溶性蛋白含量的提取和測(cè)定2.4.5.2中POD同工酶的材料預(yù)備與提取一樣，可溶性蛋白含量測(cè)定方法參考《生物化學(xué)試驗(yàn)原理和方法》(李建武等編，2023)。POD、EST同工酶材料預(yù)備與提?。喝12黃瓜植株子房在M99、W5培育基上離體培育，分別取0d、3d、6d…的黃瓜子房材料各1g，加2g樣品提取液，冰浴研成勻槳，然后4℃下離心10min(10000r／min)，上清夜即酶液。其中POD同工酶樣品提取液為pH=7.0磷酸緩沖液硫基乙醇；EST同工酶的樣品提取液為pH=6.4的磷酸緩沖液+0.1%硫基乙醇(陳啟林，1999)。Bio-RADMiniTrans-Blotcell穩(wěn)壓電泳儀和雙面垂直泳槽在室溫中進(jìn)展電泳時(shí)分別膠濃度為120V穩(wěn)壓電泳3~4h。過(guò)氧化物酶同工酶承受聯(lián)苯胺染色法；酯酶同工酶染色承受堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽法。同工酶電泳均重復(fù)3次?？偟鞍讟悠返闹苽湟苑至崖瘦^高的3號(hào)品系為供體材料，取開(kāi)花前l(fā)天未受精子房，經(jīng)外表滅菌后接種至M99培育基上培育，與培育的第0d、3d、6d和l0d分別取外植體2g，先用蒸餾水洗凈，吸干外表水，再用塑料膜小袋包裝后快速置于-80℃保存?zhèn)溆?。參照Damerval(1986)等的方法制備總蛋白樣品。/提取液(w/v)1:4的比例懸浮于-20℃的丙酮提取液中(含10%TCA，0.07%(—ME)，-20℃沉淀2h；15,000rpm，4℃條件下離心20min，棄上清液；沉淀重懸浮-20℃的丙酮中(含0.07%(—ME)，-20℃沉淀1h；15,000rpm，4℃條件下離心20min4℃下真空枯燥，然后保存于-20℃冰箱中待丙酮完全揮發(fā)后即可使用。上樣前，樣品按lmg.20μ1樣品溶解緩沖液(1ysisbuffer)溶解，Eppendorf離心機(jī)最高速離心20min，取上清液上樣。和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記均購(gòu)自Phamarcia公司，聚丙烯酰胺、尿素等購(gòu)自上海生工公司。雙向聚丙烯藏胺凝膠電泳(IEF/SDS-PAGB)(ZEF/SDS-)技術(shù)分別特異蛋白質(zhì)。電泳參照等的方法進(jìn)展并加以改進(jìn)。第一向等電聚焦電泳(IEF)：灌制IEF柱膠，上面注少許重蒸水隔離空氣并壓平膠面。柱高11.5cm，直徑2mm。每管上樣量100μ1(濃度5.5mg/ml，共約550mg蛋白質(zhì))。全蛋白質(zhì)濃度測(cè)定承受紫外吸取差值閱歷公式：蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=1.55×0.D.2800.76×O.D.260(李立人和王維光，1991)。電極液正極為0.01MH3PO4，負(fù)極為0.02MNaOH。室溫下按以下程序進(jìn)展電泳：①預(yù)電泳，200V15min；300V30min；400V30min。②正式電泳，500V6h以上；600V10h：800V1.5h。電泳后，膠條用12.5%三氯乙酸(TCA)固定5min，再轉(zhuǎn)移到雙蒸水中漂洗兩次直至膠條背景透亮為止(約5min左右)15min-20℃以下保存?zhèn)溆?。的分別膠，再灌濃度為4%的濃縮膠。垂直平板規(guī)格20×17×0.1cm.IEF膠條用1%瓊脂糖(用凝膠平衡液配酚藍(lán)前沿距凝膠底邊0.1cm時(shí)，停頓電泳并取膠。承受銀染或CBBR-250染色。主要試劑配方如下：①lysisbuffer(參照Damervaleta1.，1986的方法配置)：100mlUrea(9.5M)β-Mercaptoethanol(5%)NP-40(2%)40%Ampholine(pH6.0~8.0)40%Ampholine(pH3.5~10.0)ddH2O4℃保存。②IEF膠的配方:10mlUreaArc(28.38%)-Bis(1.62%)10%NP-40ddH2O40%Ampholine(PH5.0-7.0)40%Ampholine(PH6.O-8.0)40%Ampholine(PH3.5-10.0)10%APTEMED③分別膠配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris～HCl(PH8.8，1.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED④濃縮膠配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris+HCl(PH6.8.0.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED⑤凝膠平衡液：100mlGlycerin(10%)SDS(4%)Tris—HCl(pH6.8，0.1M)

57.06g5ml2ml1.6ml0.4ml→100m15.5g1.33ml2.0ml1.97ml200μml200μml100μml10μml3.5μl100ml25.0ml33.23ml100μml100μml40μml16.5ml26.3ml55.62ml1ml1ml80μml10ml4g1.21gβ—ME(2%) 2mlddH2O →100m1⑥SDS-電極緩沖液(10×)：100mlSDS(1%) 1gTris(3.22%) 3.22gGlycine(14.1%) 14.1gddH2O →100m1銀染(19