卡托普利從多肽到小分子降血壓藥物的研發(fā)歷程

卡托普利：從肽到小子降血壓藥物的研發(fā)歷程高血壓是一種以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病床上高血壓主要分為兩大類發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓中原發(fā)性高血壓占高血壓患者90%上發(fā)病機(jī)制尚不明確能與神經(jīng)機(jī)制臟機(jī)制素機(jī)制、血管機(jī)制、胰島素機(jī)制等密切相關(guān)?；颊哂捎谘獕荷撸呐K需超負(fù)荷工作，以便泵送足夠的血液及氧氣來維持正常的身體機(jī)能果不及時治療能會導(dǎo)致心臟相關(guān)疾病臟損傷和眼睛等器官生組織報告，1980年全球有6億人患有高血壓，而2008年患病人數(shù)升高到10億，預(yù)計到2020年這一人數(shù)可能會達(dá)到15億血壓的患病人數(shù)也一直居高不下，因此抗高血壓藥物的開發(fā)具有巨大的社會及經(jīng)濟(jì)價值。人類對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting用機(jī)制的解析被認(rèn)為是高血壓治療的重要突破現(xiàn)主要是基于對體內(nèi)腎臟中的腎素血管緊張素-醛固酮(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)統(tǒng)的認(rèn)識腎臟產(chǎn)生的一種升壓調(diào)節(jié)體系素通常是由腎臟內(nèi)的腎小球旁器官產(chǎn)生和分泌應(yīng)對血壓下降或過濾后的氯化鈉濃度下降方面泌的腎素將肝血管緊張素原裂解成無活性的血管緊張素Ⅰ，然后通過ACE將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為活性的血管緊張素Ⅱ管緊張素Ⅱ有許多生理作用增加血管阻力，作用于腎上腺皮質(zhì)釋放醛固酮，刺激后垂體釋放抗利尿激素加壓素，刺激口渴中樞進(jìn)交感神經(jīng)末梢去甲腎上腺素釋放制去甲腎上腺素的再攝取時管緊張素Ⅱ也作為激動劑將其受體激活而引起一系列相應(yīng)的生理變化，最終導(dǎo)致血管壁緊縮、血壓升高。另一方面，血管緩激肽本身是具有促

進(jìn)血管擴(kuò)張、降低血壓的作用。而ACE可促進(jìn)緩激肽的降解、失活，間接引起血壓的升高見圖1)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-convertingenzymeinhibitors，可作為降壓藥物，其降壓原理主要是通過阻斷RAAS系統(tǒng)，抑制ACE活性而抑制循環(huán)及局部組織血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ血管緊張素Ⅱ生成減少，抑制緩激肽降解，從而具有舒張血管、降低血壓的作用?？ㄍ衅绽唐访鸆aptopril)是一代口服源于巴西蛇毒中的一種緩激肽，能夠有效地治療各種原發(fā)性高血壓，具有起效迅速、降壓平穩(wěn)、遠(yuǎn)期療效突出等優(yōu)點(diǎn)時對心力衰竭和糖尿病病也有良好的治療效果托普利的問世開啟了高血壓藥物治療的新時代。時至今日，以卡托普利為代表的ACEI研究，仍是藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。盡管ACEI鈣離子通道拮抗劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等各類抗高血壓新藥層出不窮，但卡托普利仍在高血壓的臨床治療中扮演著重要的角色。1卡托普利1.1苗頭化合物teprotide現(xiàn)早在1933年RochaeSilva現(xiàn)被巴西蝮蛇咬傷的患者會因為低血壓休克而死亡此猜想蛇毒中應(yīng)該含有一降壓物質(zhì)到1948Silva于成功地從巴西蝮蛇的蛇毒中提取出這種“降壓物質(zhì)”，并通過結(jié)構(gòu)鑒定，確證該物質(zhì)是一種直鏈的九肽化合物，命名為“緩激(bradykinin,簡”只有在蛇毒體內(nèi)才能穩(wěn)定存在，在人體內(nèi)的半衰期極短幾分鐘便會完全分解此究人員猜測毒蛇體內(nèi)可能存在一種穩(wěn)定BK生源物質(zhì)，于是對生源物質(zhì)展開了研究。

1960年，和Vzne發(fā)現(xiàn)巴西蛇毒中含有一種“緩激肽增強(qiáng)因子(bradykininpotentiating稱BPF)時究結(jié)果表明在一定程度上抑制緩激肽降解酶而減緩緩激肽的降解，并且發(fā)現(xiàn)該化合物可與體外制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)現(xiàn)了有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑此研究結(jié)果等

先后從蛇毒提取液中分離得到不同的緩激肽增強(qiáng)因子且報道了這些長肽的氨基酸序列的合成合比較幾種多肽后現(xiàn)五肽BPP對ACE抑制活性最好，但其體內(nèi)的半衰期非常短。而九肽SQ20881(teprotide)制活性僅次于BPP，但卻擁有相對較長的體內(nèi)半衰期(T=2.5。隨后VandongenGreenwood兩位科學(xué)家開展了teprotide腎灌注大鼠和異丙腎上腺素刺激腎素分泌的大鼠的影響究發(fā)現(xiàn)小teprotide用量時鼠血壓升高中血管緊張素Ⅰ被轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ。另外管緊張素Ⅰ的轉(zhuǎn)化也會影響腎素分泌和對異丙腎上腺素的刺激反應(yīng)終隨著teprotide床試驗的不斷推進(jìn)人員確證teprotide是一種有效的它是一種大分子肽類化合物類藥物的缺點(diǎn)生物利用度低、只能通過注射給藥，從而限制了其在臨床上的使用。1.2先導(dǎo)化合物1的確定為了克服肽類藥物的缺點(diǎn)，該類藥物研發(fā)的重點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向可口服的小分子ACEI開發(fā)，研究策略主要是探究teprotide的藥效團(tuán)，簡化化合物結(jié)構(gòu)，降低分子量，提高成藥性。由于該多肽是大分子，可能具有一定程度的二級或三級結(jié)構(gòu)，使其與ACE的活性位點(diǎn)之間進(jìn)行特異的結(jié)合。生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素與羧肽酶A均為肽類外切酶，這兩種酶在序列上具有45.2%似性，而當(dāng)時羧肽酶A相較血管緊張素的研究較為充分，羧肽酶

的蛋白結(jié)構(gòu)已被成功解析，并且已有相關(guān)的羧肽酶A抑制劑報道。但由于當(dāng)時計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)并不成熟員也無法基于羧肽酶的結(jié)構(gòu)去對血管緊張素進(jìn)行同源模建，獲得血管緊張素的蛋白結(jié)構(gòu)，研究人員無法基于ACE的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行化合物設(shè)計。因此，Cushman和Ondetti只能先探討teprotide與羧肽酶A活性位點(diǎn)可能的相互作用模式，用來指導(dǎo)teprotide的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。羧肽酶中正電性的與teprotide-末端負(fù)電性的芐基琥珀酸形成靜電相互作用，同時羧肽酶A中疏水性氨基酸與底物中的苯環(huán)形成的疏水相互作用見圖2)。此外，羧肽酶Zn與底物的羰基相互作用，并促進(jìn)該位點(diǎn)的酰胺鍵水解。盡管血管緊張素轉(zhuǎn)換酶與羧肽酶A的活性位點(diǎn)非常類似，但其中也存在一定的差異：①對于羧基靜電相互作用區(qū)以及結(jié)合區(qū)之間的距離ACE于羧肽酶A，此在ACEZn可能參與末端倒數(shù)第二個氨基酸水解非最后一個肽鍵的水解見圖3)及羧肽酶與底物疏水側(cè)鏈結(jié)合的疏水口袋差別較大，ACE為圓形，羧肽酶A為六邊形口袋(見圖2a、2b)；③在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性位點(diǎn)上存在氫鍵供體與底物的羰基形成的氫鍵相互作用肽酶A無該氫鍵作用上的蛋白與小分子結(jié)合作用差異明ACE制劑不同于羧肽酶抑制劑，ACE抑制劑至少應(yīng)具有二肽的結(jié)構(gòu)單元。CushmanOndetti綜合分析苗頭化合物teprotideBPP的結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系以及受體與配體的結(jié)合模式，得到了關(guān)鍵酶結(jié)合底物Ⅰ(substrate。Ⅰ有以下特征：①化合端的脯氨酸處于ACE結(jié)合口袋，對整個化合物的活性至關(guān)重要，是關(guān)鍵的藥效基團(tuán)，負(fù)電性羧基不僅與靶蛋白中正電性Arg145基形成靜電相互作用，同時脯氨酸側(cè)鏈還伸入疏水空腔中，與靶蛋白形成疏水作用酸相連接的丙氨酸靶蛋白形成氫鍵相互作用，

而發(fā)揮抑制活性該底物對ACE抑制活性較弱僅為600此該化合物仍需進(jìn)一步活性優(yōu)化。Cushman和Ondetti進(jìn)一步參考了羧肽酶A和其抑制劑的結(jié)合模式，并模擬ACE與底物Ⅰ的結(jié)合方式，經(jīng)過生物電子等排設(shè)計得到先導(dǎo)化合物1該化合物對ACE有一定的抑制活性(IC=330μmol·L。2羧Ab.

311.3先導(dǎo)化合物1的結(jié)構(gòu)優(yōu)化先導(dǎo)化合物盡管活性仍較差，但從結(jié)構(gòu)上已經(jīng)較之前的九肽簡化很多導(dǎo)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化新型的ACEI通過前期對ACE作用機(jī)制研究現(xiàn)ACE的活性中心會有個結(jié)合位點(diǎn)了獲得活性及理化性質(zhì)更優(yōu)的候選藥物CushmanOndetti對先導(dǎo)化合物的5個結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計、合成了一系列新的衍生物。1.3.1ACE正電活性位點(diǎn)和疏水空腔的結(jié)合基團(tuán)優(yōu)化通過對該作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)配體基團(tuán)伸入ACE的結(jié)合口袋，一般是以氨基酸取代最優(yōu)。因此和Ondetti計了一系列不同氨基酸取代的衍生物望能夠獲得活性更優(yōu)的化合物(見表。

表1是不同氨基酸殘基取代后的活性結(jié)果體來看性越強(qiáng)的氨基酸進(jìn)行取代，活性越好。結(jié)果顯示：脯氨酸取代的活性最好，可能由于脯氨酸的五元雜環(huán)與疏水口袋更加疏水結(jié)合更強(qiáng)酸替換為其他氨基酸殘基反而會降低化合物活性；另外比較L

構(gòu)型和D型的脯氨酸和苯丙氨酸，發(fā)現(xiàn)L

構(gòu)型抑制活性遠(yuǎn)優(yōu)于型，表明L好的空間匹配與能量契合。

構(gòu)型氨基酸更易與ACE電活性位點(diǎn)，形成更1ACE*1.3.2依據(jù)與活性中心的Zn的螯合作用進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化ACE的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和羧肽酶A較為類似，依據(jù)芐基琥珀酸與羧肽酶A的結(jié)合特點(diǎn)，芐基琥珀酸會與活性中心Zn進(jìn)行螯合該配位鍵作用相比氫鍵作用水作用以及范德華作用更強(qiáng)，因此該配位鍵作用較為重要。因此，與ACE活性中心Zn形成配位的基團(tuán)對整個化合物的活性至關(guān)重要。于是，Cushman和Ondett對該作用位點(diǎn)的基團(tuán)進(jìn)行一系列的替換入Zn形成配位鍵的基團(tuán)-SH磷酸基團(tuán)等，相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)和活性對應(yīng)關(guān)系如表2示。2不同離

*活性測試結(jié)果表明部分的取代基對化合物活性影響較大酸基團(tuán)取代的化合物15較先導(dǎo)化合物1體外酶活性提升了40倍左右；而巰基取代的化合物13先導(dǎo)化合物的體外酶活性提高了約1600倍左右?guī)€基和活性位點(diǎn)的Zn離子結(jié)合最好，磷酸次之，羧酸和子結(jié)合效果最差，后期的結(jié)構(gòu)優(yōu)化主要以巰基為主。1.3.3脂肪鏈長度對活性影響考慮到脂肪鏈的長度一方面直接影響整個化合物的理化性質(zhì)影響巰基與的相互作用以及C-末端脯氨酸與2+的靜電相互作用水相互作用此究人員對該位置的脂肪鏈長度進(jìn)行延長或縮短，期望能夠進(jìn)一步增強(qiáng)化合物與相互作用，從而提高化合物活性(表3)。3

*表3活性數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，當(dāng)碳原子數(shù)為1和2時，活性較優(yōu)，對體外酶抑制活性分別為1.10.2μmol·L。而當(dāng)碳原子數(shù)小1或者大于2，化合物-1活性顯著降低。因此，研究人員繼續(xù)以化合物為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。1.3.4脂肪鏈上取代基優(yōu)化由圖2可知物的9位與ACE活性位點(diǎn)之間可能存在相互作用。另外，結(jié)合底物Ⅰ的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)之前有甲基取代。于是，研究人員在脂肪碳鏈的8位和9位分別引入甲基，繼續(xù)研究化合物的構(gòu)效關(guān)系見表4)。4*表4活性測試結(jié)果表明，9有甲基取代，化合22性降低。8位引入甲基，S構(gòu)型的化合物21較化合物13活性降低；但是，R型的化合物

20化合物13活性提高了左右引入R構(gòu)型的甲基更易與ACE的活性位點(diǎn)相互作用。1.4卡托普利上市及后續(xù)進(jìn)展最后，研究人員開展了化合物20(托普利)對腎臟高血壓大鼠和正常血壓大鼠的體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(見圖4)，發(fā)現(xiàn)卡托普利對腎高血壓大鼠具有非常好的降壓效果，而對正常血壓大鼠并沒有明顯影響。再結(jié)合之前不同衍生物對ACE酶水平的抑制活性研究，研究人員正式將卡托普利作為候選藥物，并于1977年全面開始臨床研究1981順利獲得FDA批準(zhǔn)上市，成為首個上市的普利類ACEI。隨著默沙東研發(fā)團(tuán)隊對卡托普利上市后的持續(xù)關(guān)注基的引入帶來了強(qiáng)療效的同時也帶來了許多副作用，例如皮疹、瘙癢以及味覺障礙等。于是，研究人員將卡托普利上的巰基直接用羧基替換，再對結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，最后發(fā)現(xiàn)用α-基苯丙胺取代時活性最好，其改善了與活性中心的親和力，即依拉普利拉(Enalaprilat)是拉普利拉的口服生物利用度太差衰期短(T=0.5，F(xiàn)%<10%)。研究人員通過前藥設(shè)計的概念，將依拉普利拉的羧基做成單乙酯，提高了脂溶性，也就是現(xiàn)在的依拉普利(Enalapril)(二甲酸類，并在1985年被FDA批上市。依拉普利具有較優(yōu)的透膜性，易吸=11在體內(nèi)水解成羧酸再游離出來而發(fā)揮降血壓的作用為繼卡托普利后又一治療高血壓的重磅藥物著藥物化學(xué)家們對普利類藥物的繼續(xù)研究相繼設(shè)計了許多不含巰基的二甲酸類藥物，包括如：雷米普利貝那普利(Benazepril)新產(chǎn)品。這些普利類藥物都表現(xiàn)出優(yōu)良的降血壓效果，為高血壓病人戰(zhàn)勝疾病帶來了福音。

42總結(jié)