分章第01蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第一章StructureandFunctionofProtein蛋白質(zhì)研究的歷史1833年，Payen和Persoz分離出淀粉酶。1838年，荷蘭科學(xué)家G.J.Mulder引入“protein”（源自希臘字proteios，意為primary）一詞

1864年，Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，并將其制成結(jié)晶。19世紀(jì)末，F(xiàn)ischer證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，并將氨基酸合成了多種短肽。1951年,

Pauling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)——α-螺旋(α-helix)。1953年，F(xiàn)rederickSanger完成胰島素一級序列測定。1962年，JohnKendrew和MaxPerutz確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)90年代以后，隨著人類基因組計劃實施，功能基因組與蛋白質(zhì)組計劃的展開，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究達到新的高峰。一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性1.蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。1）作為生物催化劑（酶）2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能2）代謝調(diào)節(jié)作用參與基因調(diào)控的組蛋白、非組蛋白等參與代謝調(diào)控：如激素或生長因子等3）免疫保護作用

抗原抗體反應(yīng)凝血機制4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲血紅蛋白——運輸氧銅藍蛋白——運輸銅鐵蛋白——

貯存鐵5）運動與支持作用

機體的結(jié)構(gòu)蛋白：頭發(fā)、骨骼、牙齒、肌肉等6）參與細(xì)胞間信息傳遞

7）氧化供能信號傳導(dǎo)中的受體等蛋白質(zhì)的分子組成

TheMolecularComponentofProtein第一節(jié)組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘

。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。凱式定氮法：由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點一、氨基酸

——組成蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸（甘氨酸除外）。Gly——沒有手性H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R

基本氨基酸中，除脯氨酸和甘氨酸外其余均屬于L-α-氨基酸。例外：Pro——亞氨基酸Gly——沒有手性非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸（一）氨基酸的分類分類依據(jù)：R側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的不同(一)側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸(二)側(cè)鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸(三)側(cè)鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸TrpTyr(四)側(cè)鏈含負(fù)性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸(五)側(cè)鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸另外：1、蛋白質(zhì)中的很多氨基酸是經(jīng)過加工修飾的，稱為修飾氨基酸如：脯氨酸羥基化成羥脯氨酸

賴氨酸羥基化成羥賴氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在幾種特殊氨基酸脯氨酸（亞氨基酸）

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH

硒代半胱氨酸在某些情況下也可用于合成蛋白質(zhì)。存在于過氧化物酶和電子傳遞鏈中的還原酶等。硒代半胱氨酸參與蛋白質(zhì)合成時，并不是由目前已知的密碼子編碼，具體機制尚不完全清楚。體內(nèi)也存在若干不參與蛋白質(zhì)合成但具有重要生理作用的L-α-氨基酸，如參與合成尿素的鳥氨酸（ornithine）、瓜氨酸（citrulline）和精氨酸代琥珀酸（argininosuccinate）。（二）氨基酸的理化性質(zhì)1.兩性解離及等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反應(yīng)氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。二、肽*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。（一）肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。多肽鏈有方向性：Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端N末端C末端牛核糖核酸酶（二）幾種生物活性肽

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH有抗氧化劑的作用，可還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：

－SH為親核性，與親電子性的毒物或藥物結(jié)合參與氧化還原反應(yīng)：

－提供H原子保護巰基酶的活性：

－使巰基酶的活性基團-SH維持還原狀態(tài)抗氧化劑作用，維持紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定：

－去除H2O2，起抗氧化劑的作用

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽神經(jīng)肽(neuropeptide)2.多肽類激素及神經(jīng)肽蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

TheMolecularStructureofProtein

第二節(jié)蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來的，具有特定分子結(jié)構(gòu)的高分子化合物。構(gòu)象是由于有機分子中單鍵的旋轉(zhuǎn)所形成的。蛋白質(zhì)的構(gòu)象通常由非共價鍵（次級鍵）來維系蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括

一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)高級結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)分子中的非共價鍵(次級鍵)1.氫鍵(hydrogenbond)

：常見于連接在一電負(fù)性很強的原子（O、N等）上的氫原子，與另一電負(fù)性很強的原子（O、N等）之間。鍵能較低(~12kJ/mol)，易被破壞2.疏水鍵：非極性物質(zhì)在含水的極性環(huán)境中存在時，會產(chǎn)生一種相互聚集的力，這種力稱為疏水鍵或疏水作用力。蛋白質(zhì)分子中的許多氨基酸殘基側(cè)鏈也是非極性的，這些非極性的基團在水中也可相互聚集，形成疏水鍵，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的側(cè)鏈基團。3.離子鍵（鹽鍵）：離子鍵(saltbond)是由帶正電荷基團與帶負(fù)電荷基團之間相互吸引而形成的化學(xué)鍵。4．范德華氏（vanderWaals)引力：原子之間存在的相互作用力。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。(包括蛋白質(zhì)分子中所有的二硫鍵的位置）二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。維系鍵：定義：肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫目前已知一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)數(shù)量已相當(dāng)可觀，并且還以更快的速度增加。國際互聯(lián)網(wǎng)有若干重要的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，例如EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataLibrary）Genbank（GeneticSequenceDatabank）PIR（ProteinIdentificationResourceSequenceDatabase）大量蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及其他資料，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的深入研究提供了便利。三、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義

主要的維系鍵：

氫鍵主鏈骨架

由于C=O雙鍵中的π電子云與N原子上的未共用電子對發(fā)生“電子共振”，使肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)原則肽平面——由于肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，使參與肽鍵構(gòu)成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽平面或肽單元。（一）肽平面由于α-碳原子與其他原子之間均形成單鍵，因此兩相鄰的肽鍵平面可以作相對旋轉(zhuǎn)(二）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil)

1.α-螺旋：α-螺旋是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構(gòu)象

結(jié)構(gòu)特征：⑴為一右手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)⑵螺旋每圈包含3.6個氨基酸殘基,螺距0.54nm；⑶螺旋以氫鍵維系（氨基酸的N-H和相鄰第四個氨基酸的羰基氧C=O之間。氫鍵方向與螺旋軸基本平行）

2.-折疊β-折疊是由若干肽段或肽鏈排列起來所形成的扇面狀片層構(gòu)象β-折疊包括平行式和反平行式兩種類型結(jié)構(gòu)特征：⑴由若干條肽段或肽鏈平行或反平行排列組成片狀結(jié)構(gòu)；⑵主鏈骨架伸展呈鋸齒狀；⑶涉及的肽段較短，一般為5～10個氨基酸殘基；⑷借相鄰主鏈之間的氫鍵維系。3.-轉(zhuǎn)角是多肽鏈180°回折部分所形成的一種二級結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。

4.無規(guī)卷曲（三）模體(motif)在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，被稱為超二級結(jié)構(gòu)或模體——具有特征性氨基酸序列并有相關(guān)功能鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體螺旋－折疊－折疊2個His和2個Cys與Zn離子結(jié)合螺旋區(qū)與DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)（四）氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。

四、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)次級鍵:疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范德華力二硫鍵主要的維系鍵：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子（主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的排布位置。（一）定義定義

肌紅蛋白(Mb)

N端C端為單肽蛋白質(zhì)，含有153個氨基酸，有8個螺旋區(qū)三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)對于單一多肽鏈的蛋白質(zhì)，三級結(jié)構(gòu)是它的最高級結(jié)構(gòu)，只有具有完整的三級結(jié)構(gòu)，才具有全部的生物學(xué)功能纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域（二）結(jié)構(gòu)域大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域(domain)。（三）分子伴侶(chaperon)分子伴侶通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu).*可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此重復(fù)進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。*可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。*在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用主要是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。定義維系鍵：胰島素受體：由4個亞基組成(α2β2)，α亞基與β亞基形成單體(monomer)，2個單體形成二聚體(dimer)。

同源二聚體

異源二聚體血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)

血紅蛋白的四個亞基緊密結(jié)合，亞基之間的維系鍵是亞基之間的8個鹽鍵注意：對于多條肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)，只有存在四級結(jié)構(gòu)才有功能單個的亞基沒有生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)家族（proteinfamily）

:氨基酸序列相似而且空間結(jié)構(gòu)與功能也十分相近的蛋白質(zhì)。屬于同一蛋白質(zhì)家族的成員，稱為同源蛋白質(zhì)（homologousprotein）。

蛋白質(zhì)超家族（superfamily）

:2個或2個以上的蛋白質(zhì)家族之間，其氨基酸序列的相似性并不高，但含有發(fā)揮相似作用的同一模體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性十種生物與人的細(xì)胞色素C的氨基酸組成的差異生物名稱與組成人的細(xì)胞色素C的氨基酸的差別黑猩猩0獼猴1狗11馬12雞13金槍魚21果蠅27向日葵38鏈孢霉43螺旋菌45（二）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)血紅蛋白的親水性明顯下降，從而發(fā)生聚集，使紅細(xì)胞變?yōu)殓牭稜钸@種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

肌紅蛋白Mb血紅蛋白HbHb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)血紅蛋白的四個亞基緊密結(jié)合，亞基之間的維系鍵是亞基之間的8個鹽鍵Hb未與O2結(jié)合的時候，F(xiàn)e2+位于卟啉環(huán)平面外側(cè)，與F8His連接，當(dāng)?shù)谝粋€O2與Fe2+結(jié)合后，被拉到平面中，使得牽動F8螺旋片段，導(dǎo)致亞基之間鹽鍵斷裂、結(jié)合變松弛，使易于與第二個亞基結(jié)合O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。變構(gòu)效應(yīng)與協(xié)同效應(yīng)變構(gòu)效應(yīng)：由于小分子（O2）與大分子（Hb）亞基結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變及功能變化的現(xiàn)象稱為變構(gòu)效應(yīng)。小分子物質(zhì)，稱為變構(gòu)效應(yīng)劑協(xié)同效應(yīng)：一個亞基與其配體（O2）結(jié)合后，可影響寡聚體中另一亞基與配體的結(jié)合能力的現(xiàn)象稱為協(xié)同效應(yīng)起促進作用的，為正協(xié)同效應(yīng)起抑制作用的，為負(fù)協(xié)同效應(yīng)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。ApoE與阿爾茨海默癥（AD）

阿爾茨海默病所謂的老年癡呆癥。是一種進行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙?；疾÷恃芯匡@示，美國在2000年的阿爾茨海默病例數(shù)為450萬例。60歲人群的患病率為1%，而85歲人群的患病率為30%。

載脂蛋白E（apoE）基因是老年型AD的重要危險基因。apoE4等位基因者，患AD的風(fēng)險增加，并可使發(fā)病年齡提前。但并非所謂帶apoE4等位基因的人都會患上AD，亦有許多AD患者是沒有apoE4等位基因的，國內(nèi)亦有多個報道證實apoE4是晚發(fā)型AD的危險因素之一。apoE4對他克林的治療效果不好。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑的形成。3.瘋牛病羊瘙癢癥和克雅氏癥喪失協(xié)調(diào)性站立不穩(wěn)煩躁不安奇癢難熬癱瘓死亡

朊病毒（Piron）它是一組至今不能查到任何核酸，對各種理化作用具有很強抵抗力，傳染性極強，分子量在2.7萬～3萬的蛋白質(zhì)顆粒，它是能在人和動物中引起可傳染性腦病(TSE)的一個特殊的病因。斯坦利普魯辛納（StanleyB.PPrusiner）第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein（一）蛋白質(zhì)的兩性電離一、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團。*蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷(電荷層）水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì)——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變：①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：官能團反應(yīng)性增加，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)⒈茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。⒉雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。二、蛋白質(zhì)的分離和純化（一）透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。（二）丙酮沉淀、鹽析*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。（三）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳:通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳:是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。PAGE電泳結(jié)果（四）層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。（五）超速離心

ultracentrifugation*既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉