活細(xì)胞分析檢測技術(shù)

活細(xì)胞分析檢測技術(shù)常規(guī)染色法檢測FCM技術(shù)檢測MTT法檢測MTT法的應(yīng)用活細(xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!活細(xì)胞的檢測某些染料當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)能透過變性的胞膜與解體的細(xì)胞核DNA結(jié)合，而令其著色。因而能鑒別細(xì)胞死活?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!一、臺盼藍(lán)排除法

1．試劑：

①4％臺盼藍(lán)母液：稱取4g盼藍(lán)，加少量雙蒸水研磨，加水（雙蒸）至100ml，離心后取上清液。②1.8％氯化鈉溶液。步驟：用前兩液以1:1混合，制成2%臺盼藍(lán)液。再取1滴細(xì)胞懸液和1滴2%臺盼藍(lán)液混合，放蓋片，置3分鐘，鏡下觀察200細(xì)胞。活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核呈藍(lán)色。計(jì)算百分比。活細(xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!二、中性紅排除法

步驟：（1）配1%中性紅水溶液（雙蒸水）。（2）染前用Hanks液作10倍稀釋，離心（1500轉(zhuǎn)/分）7分鐘，取上清為染液。（3）將細(xì)胞懸液與染液4:1混合，混勻后加蓋片靜置15～20分鐘。鏡下觀察。死細(xì)胞不著色，活細(xì)胞吸收中性紅液，呈紅色求百分率?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!四、苯胺黑排除試驗(yàn)苯胺黑染色液毒性小，較長時(shí)間染色也不致傷害細(xì)胞，使死細(xì)胞增多。死細(xì)胞著染苯胺黑較臺盼藍(lán)和中性紅略慢，可用于鑒定細(xì)胞死活和微量細(xì)胞毒。試劑：1%苯胺黑水溶液（過濾后用），含2.5%小牛血清的生理鹽水。操作步驟：（1）取細(xì)胞，制成1～5×細(xì)胞/ml懸液。（2）染前將1%苯胺黑水溶液與含血清的生理鹽水作1:9混合稀釋，使其成為0.1%苯胺黑鹽水溶液。（3）取0.1ml細(xì)胞懸液和0.1ml苯胺黑鹽水溶液混合，置室溫10分鐘。（4）取1滴染色的細(xì)胞懸液滴于載片，覆以蓋片，高倍鏡下觀察，著染藍(lán)黑色者為死細(xì)胞。數(shù)200細(xì)胞分別計(jì)數(shù)死、活者，計(jì)數(shù)活細(xì)胞百分比?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!六、溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）排除法碘化丙啶（PropidiumIodine,PI）和溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）均屬啡啶類，為核酸嵌入型染料?？汕度攵嗪塑账峤Y(jié)構(gòu)，與DUA雙鏈特異性結(jié)合?；罴?xì)胞胞膜可排斥這兩種試劑穿透進(jìn)入。而死細(xì)胞胞膜易被穿透，致使胞核著色，PI等對死活細(xì)胞的鑒別染色非常敏感，常用于FACS測定?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!單擊顯示

FCM在活細(xì)胞檢測中的應(yīng)用活細(xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶)可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開，生成藍(lán)色的產(chǎn)物formazan。根據(jù)這個(gè)原理，Mosmann于1983年創(chuàng)立了MTT檢測法，此法在測定細(xì)胞的存活和增殖方面非常有效，因?yàn)檫@種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細(xì)胞中，并且甲的形成量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前MTT測定法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-2等的檢測工作中?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!MTT測定已有效地應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究之中，如淋巴毒素，生長因子，白細(xì)胞介素-2，干擾素，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)，腫瘤壞死因子，抗腫瘤藥物的篩選以及抗人艾滋病毒（HIV）藥物的篩選。活細(xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!三、吖啶橙（AO）熒光染色法

（1）取少量血細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞或其它懸液細(xì)胞，數(shù)量在1×10級。（2）滴加0.01吖啶橙（AcriclineOrange,AO）生理鹽水液1～2滴，加蓋片后染色5分鐘。（用0.1%吖啶橙水溶液與0.1MPBS以1:9混合）。（3）熒光顯微鏡下觀察，采取激發(fā)濾片BG-12（或BV），阻斷濾片波長515nm士者。結(jié)果：活細(xì)胞的胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈綠色熒光，死細(xì)胞的胞核呈紅色熒光。嗜中性顆粒為桔紅。嗜酸和嗜堿性顆粒為鮮紅色?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!五、伊紅丫排除試驗(yàn)：試劑：生理鹽水配制0.2%伊紅丫溶液操作步驟：（1）取細(xì)胞，制成1～5×細(xì)胞/ml懸液。（2）取0.1ml細(xì)胞懸液和0.1ml伊紅丫染液混合。（3）取1滴混合液滴于載片，加蓋片后置1分鐘，在高倍鏡下觀察，著紅染色者為死細(xì)胞。數(shù)200個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)活、死細(xì)胞，求活細(xì)胞百分比?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!七、雙醋酸熒光素（FDA）染色試劑：將雙醋酸熒光素（FDA）以mlg/mc溶于丙酮，分裝作為保存液?？捎?20℃下長久保存。操作步驟；（1）用前，將保存液PBS稀釋成1:400,000。（2）將細(xì)胞滴加FDA稀釋液染色（3）將細(xì)胞標(biāo)本立即置熒光顯微鏡下，用激發(fā)濾片藍(lán)紫、紫外、陰隔濾片515nm觀察，活細(xì)胞應(yīng)呈綠色熒光?；罴?xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!八、測定細(xì)胞存活和增殖的MTT方法用MTT法測定活細(xì)胞及細(xì)胞增殖，是基于黃色的MTT能被活細(xì)胞線粒體脫氫酶（如琥珀酸脫氫酶和心肌黃酶）還原成藍(lán)色的Formazan，從而可用比色法推測細(xì)胞濃度。死細(xì)胞或紅細(xì)胞沒有這種能力。甲脯產(chǎn)生的量與細(xì)胞數(shù)成正比，活化的細(xì)胞比靜止的細(xì)胞產(chǎn)生更多甲脯，其最大優(yōu)點(diǎn)是不需要任何洗滌步驟可以在酶標(biāo)儀上快速分析和測定大量樣品。活細(xì)胞分析檢測技術(shù)共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!MTT測定法方法

對數(shù)生長期細(xì)胞按一定濃度接種100μl到96孔培養(yǎng)板(Costar)，設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，空白為不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，陰性對照為空白培養(yǎng)基及細(xì)胞。加入一定數(shù)量的MTT于孔中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。然后每孔加入formazan溶解液，其中短時(shí)溶解液以加樣器混合，放置一定時(shí)間。肉眼觀察蛋白質(zhì)絮狀沉淀情況，倒置顯微鏡下觀察針狀染料結(jié)晶的情況并判斷其溶解程度。用全自動酶標(biāo)儀(BIO-RADMod