流式檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題

流式細(xì)胞基本知識(shí)Q&A1、流式細(xì)胞儀上的FL2-WFL2-AFL2-H分別是做什么的？FL2-W是只檢測(cè)熒光的脈沖寬度，F(xiàn)L2-H是指脈沖高度。通常在做細(xì)胞周期分析時(shí)應(yīng)用，用于去除粘連細(xì)胞。2、流式同型對(duì)照怎樣選擇？同型對(duì)照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用annormalserum（與一抗相同的正常血清）（mustbethesamespeciesasprimaryantibody）。Thiscontroliseasytoachieveandcanbeusedroutinelyinimmunohistochemicalstaining.這個(gè)可以咨詢?cè)噭┥?。同型?duì)照為免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照。由于熒光標(biāo)記單抗的組來(lái)源不同，應(yīng)選用相同來(lái)源的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照來(lái)調(diào)整背景染色。舉個(gè)例子：比如檢測(cè)一抗為單抗的mouseantiratCD11b，cloneOX-42purifiedIgG，那么它的isotype是mouseIgG2a，所以可以用purified（純化的）mouseIgG2a來(lái)做OX-42的同型對(duì)照（IsotypeControl）。一般的的生物技術(shù)公司和國(guó)內(nèi)的代理都有出售。同型對(duì)照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類(lèi)，若使用直接免疫熒光染色法，同型對(duì)照也應(yīng)標(biāo)記熒光色素，如IgG1FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、FC受體介導(dǎo)的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對(duì)照與MoAb所標(biāo)記的熒光色素、濃度、F：P比值（標(biāo)記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同為最佳，這對(duì)準(zhǔn)確設(shè)定陰性與陽(yáng)性細(xì)胞的界標(biāo)有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對(duì)照，最好為同一實(shí)驗(yàn)室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。3、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻(xiàn)及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測(cè)定游離鈣的方法，具體如下：（1）

鈣熒光探針負(fù)載；（2）隨機(jī)測(cè)定每管細(xì)胞懸液樣品（以下簡(jiǎn)稱樣品）的單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，記為F值。（3）加入10%TritonX100，（破膜用）；加入1mmol/L氯化鈣，（問(wèn)題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測(cè)定熒光即Fmax值。（4）加入EGTA，20μl（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長(zhǎng)488nm測(cè)定熒光，即Fmin值。這個(gè)過(guò)程中的氯化鈣的作用如何，請(qǐng)高人指點(diǎn)，謝謝。因?yàn)檎Ｑ獫{中Ca2＋濃度是1mM，細(xì)胞外液的Ca2＋對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為最小值.生理環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度遠(yuǎn)低于細(xì)胞外液（大約1：10000），細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣影響很大。4、流式與werstern的區(qū)別，知道一些，不足之處請(qǐng)大家補(bǔ)充：（1）Western是檢測(cè)蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于檢測(cè)細(xì)胞多種類(lèi)型的蛋白；流式細(xì)胞術(shù)的方法多用于檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白，雖然也可通過(guò)Triton-X100給細(xì)胞打孔的方法來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)蛋白，但對(duì)于分泌蛋白卻是無(wú)能為力的；（2）Western測(cè)蛋白含量對(duì)抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對(duì)抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費(fèi)抗體）；（3）采用Western方法檢測(cè)細(xì)胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參，而流式一般要把每個(gè)樣品分為兩份，同時(shí)都做只加二抗（FITC標(biāo)記的）的對(duì)照，這樣平均到每個(gè)細(xì)胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了；（4）就個(gè)人經(jīng)驗(yàn)而言，流式用多抗不好，單抗標(biāo)出來(lái)不錯(cuò)。不過(guò)流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒(méi)有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測(cè)低表達(dá)的蛋白，低表達(dá)的還是采用western（尤其是化學(xué)發(fā)光底物更佳）和免疫組化更好。當(dāng)然，流式最大的一個(gè)特點(diǎn)就是，可以定量（百分比），如果是高表達(dá)的用流式細(xì)胞儀非常有優(yōu)勢(shì)。5、FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3的區(qū)別是什么?是指在不同位置測(cè)得的熒光?還是不同波長(zhǎng)的熒光?這3個(gè)參數(shù)到底測(cè)的是什么?有什么意義?你的理解是正確的，其實(shí)FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3是指不同的熒光通道.舉個(gè)例子來(lái)說(shuō)吧.我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細(xì)胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長(zhǎng)不同的綠色和橙色熒光，然后這發(fā)出的熒光再通過(guò)濾光片分開(kāi)，對(duì)應(yīng)的是不同的波長(zhǎng)的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開(kāi)了。6、用于做Western或ELISA的一抗可否用于流式細(xì)胞術(shù)？看你說(shuō)明書(shū)上是怎么說(shuō)的了，如果沒(méi)有說(shuō)就不可以做流式，需要另外買(mǎi)了。7、MFI和GFI的意義？GeoMean，叫做幾何均數(shù)（geometricmean），常用于等級(jí)資料和對(duì)數(shù)正態(tài)分布資料，和常用的算數(shù)均數(shù)（mean）的計(jì)算方法不同?！?total或者%gate的結(jié)果”代表的是百分率，即細(xì)胞占總體細(xì)胞或者是門(mén)內(nèi)細(xì)胞的百分比；用百分比作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，適用于熒光表達(dá)較強(qiáng)的指標(biāo)。我看到你的流式圖上，檢測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度不是很強(qiáng)，屬于弱表達(dá)的指標(biāo)，若用百分率統(tǒng)計(jì)，就是會(huì)失去一部分弱陽(yáng)性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強(qiáng)度（也就是mean值）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，比較熒光強(qiáng)度的變化。8、流式技術(shù)中的APC，pure標(biāo)記是什么意思呢?熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)后，處于一個(gè)能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)的光的一類(lèi)物質(zhì)。當(dāng)然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的，如一些生物可以發(fā)射熒光，如熒火蟲(chóng)，發(fā)光細(xì)菌等，他們發(fā)出的光是通過(guò)體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，這個(gè)酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì)，它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見(jiàn)光，常用于DNA、RNA電泳中。APC英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大發(fā)射熒光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600-640nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)。PerCP英文全名：peridininchlorophyllprotein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；最大激發(fā)波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光峰值約為677nm，與FITC、PE進(jìn)行多色熒光染色補(bǔ)償重疊較少，非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用，但量子產(chǎn)量不高，多用于檢測(cè)表達(dá)較高的抗原。9、怎樣用流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定小鼠BMDC？檢測(cè)小鼠BMDC主要是從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子兩方面來(lái)鑒定我做的時(shí)候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡（掃描和透射），另外檢測(cè)了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。還做了MHCII類(lèi)分子的檢測(cè)，還有MHCI類(lèi)分子的檢測(cè)，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面也有表達(dá)，所以目前并沒(méi)有非常特異性的方法檢測(cè)你的細(xì)胞一定就是DC，但是從形態(tài)和表面分子的檢測(cè)結(jié)合來(lái)看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達(dá)水平較低，DC成熟過(guò)程中，上述分子表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，你可以在不同的培養(yǎng)時(shí)間分別檢測(cè)。10、請(qǐng)問(wèn)流式細(xì)胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對(duì)照？首先確認(rèn)你用的直標(biāo)抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來(lái)源種屬，選擇相應(yīng)的同型對(duì)照。如：你現(xiàn)在想檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞表面的CD4抗原，熒光染料為FITC，抗體來(lái)源為大鼠的IgG1亞型，即RatantiMouseCD4-FITC（IgG1），你所需要的同型對(duì)照就應(yīng)該是RatIgG1-FITC，一般的抗體說(shuō)明上都會(huì)寫(xiě)清。11、6孔板的細(xì)胞量能否做流式呀？對(duì)于6孔板而言，每孔的表面積為10cm2，依細(xì)胞種類(lèi)不同在長(zhǎng)滿時(shí)達(dá)到的數(shù)量從5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板絕對(duì)沒(méi)問(wèn)題的！甚至24孔板也可以正常做。不過(guò)用于調(diào)試儀器參數(shù)的正常細(xì)胞要多準(zhǔn)備一些。12、血液里的mononuclearcell（除外紅細(xì)胞，血小板和破碎的細(xì)胞碎片），能不能用細(xì)胞大小來(lái)gating，只看我關(guān)心的細(xì)胞？（1）紅細(xì)胞還是小一些，無(wú)法100%區(qū)分，但還是可用把大部分紅細(xì)胞gate掉。（2）溶血也很重要，如果你的紅細(xì)胞多的話。（我猜不少，如果用ficol的話）?？梢杂寐然@溶液，如ACK（Lonzo），（3）CD45是所有白細(xì)胞都表達(dá)的，可以用來(lái)區(qū)分RBCvs.WBC13、細(xì)胞膜蛋白變化是用流氏檢測(cè)好，還是要做western?膜蛋白的提取，好像很費(fèi)功夫，提取的不好，western結(jié)果也就不可信。流式需要的抗體很少，流式能夠檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的比例，western能對(duì)總的表達(dá)定量，各有有缺點(diǎn)。14、FCM檢測(cè)表達(dá)結(jié)果到底是用百分比還是MFI。我作出是單峰，原本我覺(jué)得用MFI表示較好。但我做的2個(gè)蛋白很奇怪，一個(gè)表達(dá)率高，但MFI值低；另一個(gè)表達(dá)率低，但MFI值高。我又作了SYBRGREEN定量PCR，發(fā)現(xiàn)mRNA的表達(dá)基本與百分比相符，而與MFI值不太一致。個(gè)人認(rèn)為如果有明顯陰性細(xì)胞群和陽(yáng)性細(xì)胞群，應(yīng)計(jì)算百分比；無(wú)明顯分群，僅熒光強(qiáng)度發(fā)生變化的應(yīng)該用MFI。如果是整體峰移（或者叫單峰），那么根本不存在MFI之外的任何合理的指標(biāo)，不管MFI跟其它指標(biāo)吻合度如何，這就是客觀數(shù)據(jù)、客觀事實(shí)。15、培養(yǎng)細(xì)胞的bcl-2及Bax蛋白的檢測(cè)？首先制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌后用胞內(nèi)染色試劑盒（很多公司都有，其實(shí)就是固定劑加增透/打孔劑）進(jìn)行處理，再進(jìn)行抗體孵育標(biāo)記染色，洗滌后上樣。16、流式檢測(cè)胞內(nèi)抗原時(shí)打孔液的配方？打孔液有很多種，方法也有很多。與你的實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)。我用過(guò)酒精固定或TritonX-100（我做的都是培養(yǎng)的細(xì)胞）：（1）70%的酒精固定24小時(shí)即可，不再需要再打孔。如在PI染色測(cè)細(xì)胞周期或凋亡。（2）TritonX-100是比較強(qiáng)烈的穿孔劑。0.1%TritonX-100/PBS（再加0.1%BSA）是比較溫和一點(diǎn)。濃度可適當(dāng)提高。作用時(shí)間以幾分鐘為宜。這個(gè)時(shí)間必須要自己試。時(shí)間長(zhǎng)了細(xì)胞易破裂，短了則打孔不夠。如果你要染胞漿，則時(shí)間適當(dāng)短些，如果要染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核內(nèi)等，由于要對(duì)兩層膜性結(jié)構(gòu)打孔，時(shí)間當(dāng)然會(huì)長(zhǎng)一些（3）可以試試0.1%saponin（皂素）17、標(biāo)本必須在抗體染色后30分內(nèi)檢測(cè)嗎？SOP是這么說(shuō)的：（1）Keepsamplesafterstainingcoveredwithaluminumfoilandat40C（intherefrigerator）untiltheyarerunforflowanalysis.Thesamplesshouldbeanalyzedwithin48hours.Fluorescencelosesitsbrightnessifcellsarenotkeptproperly：notat40C，orareexposedtolight（2）Ifcellsarenotfixedwithparaformaldehyde，keepthesamplesoniceandrunthemimmediatelyafterstainingisaccomplished因此，如果你沒(méi)有用PBS洗的話，可以用paraformaldehyde固定，放置48小時(shí)。洗了后應(yīng)該盡快檢測(cè)。如果做好不能及時(shí)檢測(cè)，我們一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定，4度冰箱避光貯存。一般過(guò)夜沒(méi)有問(wèn)題，第二天同樣PBS2ml洗滌細(xì)胞一次，上機(jī)檢測(cè)。18、如何分選原始紅細(xì)胞？CD71（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）--幼稚細(xì)胞的標(biāo)記CD235（GPA）--紅細(xì)胞的標(biāo)記（小鼠有Ter119）雙陽(yáng)性細(xì)胞即為幼稚紅細(xì)胞，但無(wú)法區(qū)分原始及中晚幼紅.19、請(qǐng)問(wèn)流式檢測(cè)膜蛋白表達(dá)的變化用多克隆抗體出結(jié)果的機(jī)會(huì)大嗎？流式的抗體和WB的抗體是不同的（有部分可以通用），多抗一般是大的變性蛋白為抗原制備的，而WB的中被檢測(cè)蛋白就是變性狀態(tài)，所以很吻合，而流失中一般蛋白還是保持了天然構(gòu)象，所以產(chǎn)生的多抗可能不太好，而需要用很小特定的決定簇為抗原制備單克隆抗體。20、在下最近作人外周血流式，作表面及其胞內(nèi)染色，試劑說(shuō)明書(shū)說(shuō)要先分離外周血單個(gè)核細(xì)胞再染色，我有時(shí)候分的紅細(xì)胞比較多，其他的方法試過(guò)了，都改進(jìn)的不好，我擔(dān)心紅細(xì)胞會(huì)有影響，想在分離出PBMC以后如果紅細(xì)胞比較多的話，就用紅細(xì)胞裂解液裂解一下，但是我有如下問(wèn)題，希望這樣做過(guò)的同志指點(diǎn)一下，感激不禁。（1）有人這樣在分離PBMC以后再裂解的嗎（我知道一般是在全血染色后再裂解紅細(xì)胞）？（2）這樣會(huì)影響流式檢測(cè)嗎？（3）用的裂解液配方是什么（最好是自己用過(guò)的）。（4）用法是什么｛我是在如果PBMC分出來(lái)以后要是紅細(xì)胞比較多的時(shí)候使用，這樣要怎樣把分出的PBMC稀釋，加多少裂解液裂解多長(zhǎng)時(shí)間，裂解后洗滌幾次等等｝。我曾做骨髓液分離單個(gè)核細(xì)胞而后做流式，一般來(lái)說(shuō)用Ficoll分過(guò)之后即便還有紅細(xì)胞殘留，上流式也可通過(guò)“設(shè)門(mén)”根據(jù)細(xì)胞形態(tài)大小將紅細(xì)胞剔除。若紅細(xì)胞殘留太多，則可通過(guò)紅細(xì)胞裂解液進(jìn)一步去除之。我用的裂解液配方是：碳酸氫鉀（KHCO3）1.0g氯化氨（NH4CL）8.3gEDTA-Na20.037g加雙H2O至1000ml，為工作液。配好后4度冰箱保存，使用時(shí)效果更好。我是在Ficoll分過(guò)之后用的，所以一般根據(jù)離心后EP管里細(xì)胞團(tuán)的大小加紅細(xì)胞裂解液，通常5ml骨髓液分離單個(gè)核細(xì)胞后得到的細(xì)胞再加500ul裂解液，震蕩混勻置2－5分鐘紅細(xì)胞就基本上裂解干凈了。洗滌次數(shù)看白細(xì)胞多少而定，因?yàn)橄吹拇螖?shù)越多，損失就越多。我一般洗一到兩次就OK了．做了很久沒(méi)發(fā)現(xiàn)這樣處理影響結(jié)果。有一點(diǎn)，我是在這樣處理后才標(biāo)記抗體的，樓上的說(shuō)是標(biāo)記過(guò)才溶紅細(xì)胞，所以建議在溶的時(shí)候時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，洗滌次數(shù)也不宜過(guò)多，以免將標(biāo)記上的單抗洗脫。21、請(qǐng)問(wèn)下表中流式細(xì)胞儀給出的平均值是什么意思，是怎樣得到的，有些文獻(xiàn)中提到“fluorescencepercell"，是下面的mean值嗎，還是要用mean值除以第1欄的細(xì)胞數(shù)events，才能得到fluorescencepercell？mean值就是每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，不用再除細(xì)胞數(shù)。這只是個(gè)相對(duì)值，如果求絕對(duì)值，應(yīng)用已知熒光劑濃度值對(duì)應(yīng)儀器給出的mean值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后你得到的mean值，就可以根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線查出真正的熒光濃度值。22、流式中檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的抗體有何區(qū)別？抗體只是針對(duì)相應(yīng)抗原的，至于是針對(duì)胞內(nèi)還是胞膜對(duì)你檢測(cè)來(lái)說(shuō)并無(wú)明顯影響，你只需要查清楚到底是針對(duì)哪一個(gè)部位的抗原的，應(yīng)該是可以用同一種抗體進(jìn)行檢測(cè)的，在流式操作時(shí)只需注意：如果是針對(duì)胞內(nèi)，則需要加破膜劑，讓抗體能和相應(yīng)抗原接觸，否則就不需要了。23、請(qǐng)教各位前輩：只要是熒光抗體久可以用于共聚焦顯微鏡嗎？一般情況下都是可以的。但