農業(yè)真核基因表達調控

農業(yè)真核基因表達調控第1頁/共50頁真核基因表達的調控是當前分子生物學這一前沿學科中的前沿領域，現有的研究證明，許多重要生命現象的深層問題都集結于此，形成了許多的熱點探索課題。在一定程度上可以說基因的表達調控是分子生物學的真諦所在。第2頁/共50頁真核生物細胞內絕大部分DNA是用于儲存調控信息的，用于合成蛋白質的信息僅占很小一部分。真核生物能在特定時間和特定的細胞中激活特定的基因，從而實現“預定”的、有序的、不可逆轉的分化發(fā)育過程，并使組織器官在一定環(huán)境條件下保持正常功能。真核生物基因表達的調控更加復雜、多層次、涉及更多的蛋白質因子參與。第3頁/共50頁第一節(jié)真核生物基因調控的特點第4頁/共50頁真核生物的染色質由DNA與組蛋白結合形成為核小體，活躍轉錄區(qū)與非轉錄區(qū)的核小體結構明顯不同，活躍轉錄區(qū)的DNA對核酸酶的敏感性提高。例如，當用DNA酶Ⅰ消化未發(fā)生轉錄的染色質時，通常得到的是約200bp長的片段，而在活躍轉錄區(qū)消化后形成更小的片段，且長短不一。1.染色質的結構對基因表達有調控作用第5頁/共50頁真核生物染色質由DNA與5種組蛋白結合組成，它們折疊和纏繞形成核小體，進一步折疊纏繞形成細胞分裂中期染色體。染色質的結構對基因的表達起總體控制作用。第6頁/共50頁原核生物存在正調控和負調控兩個同等重要的方面。而在真核生物中主要是正調控，且一個基因需有多個激活物誘導。3.基因表達調控的多層次性原核生物轉錄和翻譯在細胞內同一地點進行，翻譯可以對轉錄發(fā)生影響。真核生物的基因表達調控貫穿在從DNA到蛋白質的全過程，涉及基因結構的活化、轉錄的起始、轉錄本的加工、轉運和mRNA的翻譯等?；蜣D錄是遺傳信息傳遞過程中第一個具有高度選擇性的環(huán)節(jié)，真核基因的表達調控以轉錄水平為主。2.以正調控為主第7頁/共50頁4.具有細胞特異性或組織特異性在生長發(fā)育過程中，隨著細胞需求的不斷改變，各種基因變得有活性或沉寂。Kn1——決定玉米細胞命運的基因，是植物分生組織所必需的，在正常的葉片中無活性。不正確表達會刺激維管束細胞增生，形成節(jié)狀組織。擬南芥中發(fā)現類似基因——KNAT1第8頁/共50頁真核生物基因表達的調控可發(fā)生在不同水平上第9頁/共50頁第二節(jié)DNA水平的調控第10頁/共50頁基因封閉異染色質化染色體DNA的修飾染色體組蛋白的修飾基因丟失基因擴增基因重排第11頁/共50頁（1）異染色質化

緊密的染色質結構阻止基因表達，因此異染色質區(qū)的基因很少表達。可能原因：組蛋白是帶正電荷的堿性蛋白質，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，封閉了DNA分子，從而妨礙基因轉錄。1.基因封閉例如，雌性哺乳動物細胞有兩個X染色體，但雄性只有一個X染色體。為了避免雌性表現過多X染色體的基因，在胚胎時期其中一個X染色體會被去活。去活的X染色體即使在細胞分裂的間期亦表現出濃縮的異染色質狀態(tài)，能用顯微鏡觀察到。第12頁/共50頁（2）染色體DNA的修飾

DNA的甲基化修飾也可引起基因失活。真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶（m5C），甲基化最常發(fā)生在某些基因5’側區(qū)的CpG序列中，甲基化可能影響了DNA的構象或DNA的穩(wěn)定性，阻礙了轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。脊椎動物的基因組大部分CpG被甲基化，未被甲基化的CpG大多存在于經常被轉錄的基因，主要包括管家基因。第13頁/共50頁（3）染色體組蛋白的修飾

組蛋白磷酸化、乙?；⒎核鼗约癏3組蛋白巰基化等現象，會改變染色質的結構狀態(tài)，調控基因轉錄的開關。組蛋白的N端含有數個賴氨酸，它們的側鏈基團在細胞正常的pH范圍內帶正電荷，DNA的磷酸根帶負電荷，能與之緊密結合，使轉錄因子或RNA聚合酶很難與DNA結合進行轉錄。組蛋白的賴氨酸殘基被乙?；缶筒粠щ姾桑cDNA的結合力降低，有利于轉錄調控因子的結合。

組蛋白乙酰轉移酶、組蛋白去乙酰酶第14頁/共50頁基因丟失是在某些低等真核生物的個體發(fā)育過程中，細胞分化時一些不需要的基因被消除的現象。某些原生動物、昆蟲及甲殼綱動物通過這種方式可以消除某些基因的活性，控制細胞的分化。例如，馬蛔蟲體細胞核中失去一部分基因，這些基因的丟失決定了細胞的分化方向，而生殖細胞卻沒有染色體破碎和丟失現象，生殖細胞核內仍保存基因組的完整性。四膜蟲生殖細胞小核DNA——降解后剩余片段復制建成大核——具有轉錄活性2.基因丟失第15頁/共50頁基因組中的特定基因在某些情況下復制產生大量拷貝的現象，可使細胞在短期內產生大量的基因產物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調控的一種方式。3.基因擴增(geneamplification)特定的發(fā)育時期非洲爪蟾在卵裂期和胚胎期能通過rRNA基因的大量擴增形成大量核糖體，供卵裂和胚胎發(fā)育所用。特定的環(huán)境條件環(huán)境條件改變時，有些生物的基因會發(fā)生生理適應性擴增。例如組織培養(yǎng)細胞在有適當抗生素存在時，可以有選擇地擴增某一基因。異常細胞中在某些情況下基因擴增發(fā)生在異常的細胞中。人類癌細胞中的許多致癌基因，經大量擴增后高效表達，導致細胞生長失控。第16頁/共50頁原癌基因是一些與調節(jié)和控制細胞生長、分裂和細胞周期相關的基因。原癌基因的結構變化或者失控就會演變成癌基因。第17頁/共50頁某些基因片段改變原來存在的順序而重新排布的現象。重排可以僅僅是空間位置或方向的不同，也可同時伴有某些基因片段的添加或丟失。重排可使一種基因轉換為另一種基因，也可能產生一種新的基因。4.基因重排（generearrangement）非定向重排

轉座子在染色體上的移動，轉座子的插入可激活或抑制某些基因。定向重排與變換

小鼠免疫球蛋白結構基因，免疫球蛋白的肽鏈由可變區(qū)（V區(qū)）、恒定區(qū)（C區(qū)）以及連接區(qū)（J區(qū)）組成的，V、C和J基因在小鼠胚胎細胞中是相隔較遠的。當免疫細胞發(fā)育分化時，能通過基因重排，把3個遠離的基因緊密地連接在一起，從而使多個基因編碼一條肽鏈。第18頁/共50頁第三節(jié)轉錄水平的調控第19頁/共50頁原核生物基因表達是以操縱子為單位，調控區(qū)很小，調控蛋白結合在調節(jié)位點上可直接促進或抑制RNA聚合酶的結合而調控轉錄。真核生物基因組中無操縱子結構?；蜣D錄的調節(jié)區(qū)較大，轉錄激活與起始需要多種元件和蛋白因子的參與，包括啟動子、增強子、通用轉錄因子、上游因子、誘導型轉錄因子和RNA聚合酶等。轉錄調控是通過順式作用元件和反式作用因子的相互作用實現的。第20頁/共50頁調控基因表達的一段DNA序列，一般自身沒有轉錄功能,它們與特定的功能基因連鎖在一起，可與許多同起始轉錄有關的蛋白因子相互作用而調控轉錄。1.順式作用元件(cis-actingelements)啟動子(promoter)增強子（enhancer）沉默子（silencer）第21頁/共50頁轉錄起始位點附近啟動轉錄所必需的一段DNA序列。通常轉錄因子和RNA聚合酶在啟動子部位可裝配成轉錄起始復合物，從而啟動轉錄。啟動子(promoter)典型的真核基因啟動子第22頁/共50頁能顯著提高基因轉錄效率的順式調控元件。由若干短的元件組成的，增強子一般都在－100bp以上，因此又稱遠上游序列。增強子第23頁/共50頁與增強子的功能相反結構相似，對基因表達進行負調控即抑制基因的表達。與沉默子作用的蛋白因子稱為阻遏物，二者結合后能抑制基因的轉錄。沉默子是最早在酵母中發(fā)現的，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負順式作用元件的存在。

沉默子沉默子的作用可不受序列方向的影響能遠距離發(fā)揮作用并可對異源基因的表達起作用第24頁/共50頁真核RNA聚合酶不包含類似于原核生物因子的亞基，不能識別DNA上的啟動子，需借助于其他反式作用因子來辨認啟動子并解開DNA的雙螺旋，這些與順式作用元件結合而影響轉錄的可擴散蛋白稱為反式作用因子。分為三類：2.反式作用因子（trans-actingfactors）通用或基本轉錄因子結合在啟動子上與RNA聚合酶一起形成轉錄起始復合物，是RNA聚合酶轉錄起始必需的，可以維持基礎水平的轉錄。上游因子結合在啟動子和增強子的上游控制位點。可誘導因子與應答元件相互作用。第25頁/共50頁轉錄因子必需能同DNA上的調控元件識別與結合，并且這些轉錄因子還要與其他轉錄因子或RNA聚合酶之間相互作用才能形成轉錄起始復合物而起始轉錄。DNA結合結構域、轉錄激活結構域、連接區(qū)

不與DNA直接結合的轉錄因子沒有結合DNA結構域，但能通過激活轉錄結構域作用于轉錄復合體而影響轉錄效率。還有一些轉錄因子具有結合配體結構域，可以與一些小分子物質結合來調控轉錄因子自身的活性。3.反式作用因子的結構模式第26頁/共50頁由60~100個氨基酸殘基組成的幾個亞區(qū)組成。與轉錄因子結合的DNA區(qū)常是一段反向重復序列，因此許多轉錄因子常以二聚體形式與DNA結合。DNA結合結構域（DNAbindingdomain）鋅指結構域螺旋-轉角-螺旋結構域/同源異形域螺旋-環(huán)-螺旋結構域亮氨酸拉鏈第27頁/共50頁鋅指環(huán)上突出的賴氨酸和精氨酸參與同DNA的結合。每個重復的指狀結構約含23個氨基酸殘基，多個指狀結構間常通過7～8個氨基酸殘基相連。由于重復出現的-螺旋幾乎聯成一線，這種蛋白質與DNA序列的結合牢固且特異性很高。TFⅢA、SP1鋅指與基因的啟動子區(qū)結合，鋅指的尖端可進入DNA的大溝或小溝，以識別它特異結合的DNA序列并與之結合。

Cys2/His2鋅指①鋅指結構域（zincfinger）第28頁/共50頁類固醇受體家族等一些蛋白的鋅指結構為Cys2/Cys2類型，4個半胱氨酸和1個Zn2+結合。實驗表明，當將類固醇受體的后兩個半胱氨酸殘基突變?yōu)榻M氨酸殘基時，它就不能再活化其靶基因了?？梢奀ys2/Cys2鋅指和Cys2/His2鋅指是不同類型的鋅指。Cys2/Cys2鋅指第29頁/共50頁首先在原核DNA調控蛋白中發(fā)現。如降解物基因活化蛋白CAP和噬菌體的阻遏物Cro蛋白。目前發(fā)現許多真核生物的調控蛋白也含有與螺旋-轉角-螺旋相似的DNA結合結構域。例如在調控胚胎發(fā)育和正常細胞分化基因表達中起作用的調控蛋白所具有的同源異形域。②螺旋-轉角-螺旋結構域

（helix-turn-helix，HTH）

第30頁/共50頁

螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）長約20個氨基酸，至少有兩個α螺旋其間由短肽段形成的轉角或環(huán)連接，兩個這樣的motif結構以二聚體形式相連，距離正好相當于DNA一個螺距（3.4nm）,兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的大溝。第31頁/共50頁兩條均含有亮氨酸殘基的蛋白質通過疏水鍵結合成二聚體，二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基（Lys、Arg），借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結合。亮氨酸拉鏈蛋白在真核中廣泛存在，③亮氨酸拉鏈（leucinezipper,LZIP）肽鏈上每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，結果就導致這些亮氨酸殘基都在α螺旋的同一個方向出現。第32頁/共50頁

亮氨酸拉鏈第33頁/共50頁轉錄因子的DNA結合結構域本身并不具有調控轉錄活性的功能，其轉錄活化功能是由另一種結構域，即轉錄激活結構域所作用的。轉錄激活域通常是由30~100氨基酸殘基組成，根據氨基酸組成的特點主要包括以下三種類型：

轉錄激活結構域（transcriptionactivatingdomain）①酸性α-螺旋結構域②富含谷氨酰胺結構域③富含脯氨酸的結構域第34頁/共50頁①酸性α-螺旋結構域含有酸性氨基酸殘基組成的保守序列，多呈帶負電荷的疏水性α-螺旋。含有這種結構域的轉錄因子有酵母的GAL4和GCN4，哺乳動物細胞中的糖皮質激素受體以及AP1家族的Jun等。對轉錄起始的特異誘導活性相對較低，可能與TFⅡ-D復合物中某個通用因子或RNA聚合酶Ⅱ作用發(fā)揮轉錄活化功能，并有穩(wěn)定轉錄起始復合物的作用。第35頁/共50頁②富含谷氨酰胺結構域

SPl是啟動子GC盒的結合蛋白，除結合DNA的鋅指結構以外，SP1共有4個參與轉錄活化的區(qū)域，其中最強的轉錄激活域很少有極性氨基酸而谷氨酰胺含量卻達25％左右。酵母的HAP1、HAP2和哺乳動物細胞中的Oct-1、Oct-2、Jun、AP2以及血清應答因子(SRF)等都有同樣的結構域。③富含脯氨酸的結構域

CTF家族的C末端與其轉錄激活功能有關，含有20%～30%的脯氨酸殘基。脯氨酸的存在可防礙-螺旋的形成。在Oct2、Jun、AP2、SRF等哺乳動物因子中也有富含脯氨酸的結構域。第36頁/共50頁

基礎轉錄因子的調控基礎轉錄因子是所有啟動子起始RNA合成的必需因子，與RNA聚合酶結合形成圍繞在起始位點周圍的復合物，決定轉錄的起始位點。轉錄起始復合物TBP（TFⅡ-D）、TFⅡ-B和TFⅡ-F與RNA聚合酶Ⅱ可在啟動子上形成最低限度的復合物，開始轉錄mRNA，隨著TFⅡ-E和TFⅡ-H的加入形成完整的轉錄復合物并轉錄出長鏈的RNA。加入TFⅡ-A可再進一步提高轉錄效率。4.反式作用因子對轉錄的調控第37頁/共50頁TBP:TATA-bindingproteinTAFS:TBP-associatedfactors第38頁/共50頁RNA聚合酶Ⅱ的基本轉錄因子轉錄因子分子量(kD)功能TFⅡ-D(TBP)30與TATA盒結合,協助TAFs的加入TFⅡ-B33介導RNA聚合酶Ⅱ的結合,結合在起始位點處TFⅡ-F30,74大亞基-解旋酶;小亞基-攜帶RNA聚合酶ⅡTFⅡ-E34,37ATP酶,參與調節(jié)TFⅡ-H的激酶活性TFⅡ-H62,89激酶活性,使RNA聚合酶Ⅱ的CTD磷酸化TFⅡ-A12,19,35穩(wěn)定TFⅡ-D的結合,活化TBP并釋放TAFTFⅡ-I120促進TFⅡ-D的結合第39頁/共50頁RNA聚合酶Ⅱ啟動子元件與TFⅡD、A、B、F、RNA聚合酶Ⅱ、TFⅡE、H和TFⅡI等順序結合，形成最基本的轉錄起始復合物。一個啟動子要達到足夠的轉錄效率和具有特異性，要依靠上游啟動子元件、增強子和應答元件等，這些元件由上游轉錄因子或誘導型因子所識別。第40頁/共50頁上游轉錄因子識別并特異地結合在上游順式元件上，這種轉錄因子普遍存在，且活性不受調控，能作用于任何啟動子上提高啟動效率（相當于TFⅢA和TFⅢC），這是強啟動子所必需的。這些因子結合在上游元件上后并不直接作用于RNA聚合酶Ⅱ，而是作用于基礎轉錄因子，再由基礎轉錄因子作用于RNA聚合酶Ⅱ。在轉錄的啟動中，蛋白質與蛋白質之間的相互作用具有和蛋白質與DNA之間的作用同等的重要性。上游轉錄因子的調控第41頁/共50頁①結合CAATbox的轉錄因子

CTF（CAATboxtranscriptionfactor）家族是能識別CAATbox的一組轉錄因子，它們是同一基因轉錄后由不同剪接方式形成的一組mRNA翻譯產生的。CTF1的轉錄激活結構域富含脯氨酸。與CAAT框結合的另一類因子是CP家族，其成員與不同基因的啟動子中CAAT框的親合力不同。例如，CP1與-珠蛋白基因的CAAT框親和力高，而CP2與-血纖維蛋白原基因中的CAAT框親和力高。第42頁/共50頁②結合GCbox的轉錄因子

SP1可與GC框以任意的方向結合，覆蓋約20bp。在一個啟動子中常有多個SP1的結合位點，在SV40啟動子區(qū)有6個GC框全部與SP1結合。③八堿基對元件激活蛋白

八堿基對元件(ATTTGCAT)可被多個轉錄因子識別。Oct-1普遍存在于各種細胞中，主要參與組蛋白H2B等基因的表達，無組織特異性。Oct-2主要存在于B淋巴細胞中，在淋巴細胞中可活化免疫球蛋白輕鏈基因，是有組織特異性的激活因子。第43頁/共50頁在特定時間、條件或特定的組織中合成或被活化，因而有調控基因在不同時間、條件或不同地點表達的作用。與誘導型轉錄因子結合的順式作用元件稱為應答元件。

誘導型轉錄因子的調控糖皮質激素應答元件（glucocorticoidresponseelement，GRE）熱休克應答元件（heatshockresponseelement，HSE）金屬應答元件（metalresponseelement，MRE）血清應答元件（serumresponseelement，SRE）第44頁/共50頁①熱休克應答調節(jié)許多生物在最適溫度范圍以上時，受熱誘導能合成一系列熱休克蛋白（heatshockprotein），產生熱休克應答。受熱激后許多基因被關閉，而熱休克基因則被轉錄，