分子生物學(xué)之DNA復(fù)制

分子生物學(xué)之DNA復(fù)制第1頁/共83頁3.1.基本概念

(BasicConcept)第2頁/共83頁遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學(xué)的核心Watson&Crick:

一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種功能，即自我復(fù)制和對細胞的高度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制基因的突變控制性狀的表達第3頁/共83頁DNA復(fù)制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,

合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！馬eplicon;基因組中能獨立進行復(fù)制的單位。

●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

第4頁/共83頁DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs?第5頁/共83頁3.2.復(fù)制起點與方向（replicationorigin&direction）

第6頁/共83頁richAT&palindromEnzymesbindingsite復(fù)制起點的特征第7頁/共83頁E.coli復(fù)制起點ori C 245bp,序列保守成串排列的三個13bp序列四個9bp序列DnaA蛋白結(jié)合位點第8頁/共83頁真核生物復(fù)制起點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的ARS(automaticReplicationSequence)自主復(fù)制序列ARS1(A,B1,B2,B3)A區(qū)具有高度保守性B區(qū)變化較大ATrich第9頁/共83頁

復(fù)制的多模式單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向第10頁/共83頁1963Cairns37℃,5ci/mMH3-T,6min37℃,52ci/mMH3-T,6min42℃,

T,onecircleDNA雙向復(fù)制的證據(jù)模式？E.coli

mut.ts復(fù)制發(fā)動溫度敏感突變型42℃不能發(fā)動DNA復(fù)制、但可完成DNA延伸第11頁/共83頁模式？單起點、雙方向兩個復(fù)制叉第12頁/共83頁

子鏈DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCA

C5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

第13頁/共83頁如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHG

ATCG

5’pppOH3’第14頁/共83頁ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使dNTP難以聚合到DNA的5’端，而且雙鏈DNA的5’端堿基配對困難。第15頁/共83頁堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗）

A

TCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH第16頁/共83頁3.3.DNA的半保留復(fù)制（Semi-ConservationReplication）

第17頁/共83頁半保留復(fù)制的實驗驗證第18頁/共83頁3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘第19頁/共83頁onestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

？a)Okazakifragment1968ReijiOkazaki第20頁/共83頁半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication）

證據(jù)

Okazaki片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復(fù)制提供了有力的證據(jù)。Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb

在復(fù)制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)合成的復(fù)制機制。第21頁/共83頁leadingstrand

laggingstrand

leadingstrand（前導(dǎo)鏈）：連續(xù)復(fù)制laggingstrand（后隨鏈）：按Okazaki片段不連續(xù)復(fù)制第22頁/共83頁3.4.DNA復(fù)制的方式

(DNAreplicationmodel)

第23頁/共83頁startingpoint→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrand●復(fù)制叉式（replicationfork）

第24頁/共83頁環(huán)狀DNA復(fù)制（θform，50，000bp/min)多復(fù)制子真核生物（1000-3000bp/min)大多數(shù)生物染色體采取雙向?qū)ΨQ復(fù)制。枯草桿菌采取不對稱復(fù)制。第25頁/共83頁

DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復(fù)制起始.

DNA聚合酶行使聚合作用需要：引物提供3’-OH以四種dNTP作為底物模板指導(dǎo)延伸方向5’→3’第26頁/共83頁

RNA引物的合成（ATP，GTP，CTP，UTP）

RNA聚合酶和引物合成酶(primase)

引物的長度：幾個—10個核苷酸

DNA聚合酶I：RNA引物的消除和缺口的填補primer

第27頁/共83頁DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

第28頁/共83頁primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase第29頁/共83頁

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成對后隨鏈引物的合成

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolIII進行DNA鏈的延伸DNApolI對RNA引物切除并聚合填補

連接酶(ligase）將連接Okazaki片段.完成對先導(dǎo)鏈引物的合成實現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較先導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷Conclusion第30頁/共83頁●共價延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)方式（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand第31頁/共83頁ΦX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）DNA鏈，成為（+/-）雙鏈DNA分子，即復(fù)制型RFI.（+）鏈DNA復(fù)制起點被特異性A蛋白切斷，3‘和5’端游離出來。（-）DNA為模板，以（+）鏈DNA

3‘-OH為引物，DNA聚合酶III合成新鏈（+）。原來的（+）鏈DNA

被取代。（+）鏈DNA被滾出一定長度后，產(chǎn)生環(huán)狀（+）鏈DNA。（+/-）DNA鏈，繼續(xù)參與復(fù)制。第32頁/共83頁●置換式或D-Loop（Displacementform）

D.S.DNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop第33頁/共83頁TopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)DnaBproteinDnaCproteinPrimaseDNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligaseforprimosome復(fù)制體進化中形成了靈活的多酶復(fù)合體

replisome第34頁/共83頁primosome（引發(fā)體）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase(引物酶)第35頁/共83頁進化中形成了靈活的多酶復(fù)合體replisome第36頁/共83頁位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體完成

laggingStrandDNA延伸時

必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段InlaggingStrand多酶系統(tǒng)必須完成多次反復(fù)的啟動與擴展

E.coli

啟動2000—4000次的岡崎片段復(fù)制第37頁/共83頁3.5.線狀DNA的復(fù)制及避免5’末端短縮的模式

（5’-endshortend）

第38頁/共83頁3’-OH?

3‘-OHLaggingstrandof環(huán)狀DNAreplicationLaggingstrandof線狀DNAreplicationBut５‘３‘３‘５‘3’-OH?

第39頁/共83頁WatsonJ.DT7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

第40頁/共83頁??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH第41頁/共83頁b)真核生物染色體DNA末端補齊模式

●端粒的發(fā)現(xiàn)

1938MullerX-rayDrosophila

末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為Telomer

1938B.McClintock

頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。1970s分子生物學(xué)發(fā)展端粒研究獲得突破第42頁/共83頁●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.四膜蟲端粒酶（telomerase

）將T2G4

末端重復(fù)延伸

=RNA(CAACCCCAA)鏈+端粒結(jié)合蛋白

第43頁/共83頁●model

Telomerase是反轉(zhuǎn)錄酶

RNA與3’endofDNA互補,作為合成cDNA的模板T2G4的延伸以端粒3’-end作引物G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’TTG第44頁/共83頁G鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4---TTG

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’GGGTTGG鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----TTGGGGTTGGGGTTG

------

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’第45頁/共83頁GGhoogsteenbond

四股螺旋

G鏈–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----G鏈–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC鏈--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolor第46頁/共83頁多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達信息DNA（informationalDNA）,細胞將逐漸衰老和死亡。

細胞分裂端粒閾值細胞停止分裂或死亡Whentelomeraseactivity

isrepressed第47頁/共83頁人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈反比細胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活性

Harley(1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測胎兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株老年細胞株年齡小大端粒長度

長短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短PCD機制、癌細胞的無限繁殖(癌細胞中的端粒酶被激活)第48頁/共83頁

3.6TheterminationofDNAreplication

第49頁/共83頁E.coli(單起點雙方向)兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復(fù)制叉簡單相遇）

terE,D,AterF,B,C(22bp保守區(qū))FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS復(fù)合體第50頁/共83頁terE,D,A僅對逆時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)

terF,B,C僅對順時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng)FBCADETer-TUS復(fù)合體(Rep.forktrap)終止DnaB(螺旋酶)防止DNA過度復(fù)制避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝第51頁/共83頁環(huán)狀DNA分子復(fù)制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體。需要拓撲異構(gòu)酶使DNA兩條鏈斷開和再連接。第52頁/共83頁3.7.

DNA的復(fù)制基因與酶類體系

第53頁/共83頁原核生物的酶類

與起始有關(guān)的蛋白因子

DnaB

解開ＤＮＡ雙鏈300kdhexamerRNApolRNAprimerforleadingstrandDnaC

與DnaB相互作用25kdDnaGRNAprimerforlaggingStrand60kd

SSB

結(jié)合單鏈DNA74kd第54頁/共83頁Elongationgenes與酶dnaE

DNApolymeraseIII(α)140kddnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kdpolA

DNApolymeraseI109kdpolB

DNApolymeraseII90-120kd第55頁/共83頁解螺旋酶和連接酶rep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAligLigase缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口連接dAMP第56頁/共83頁復(fù)制叉兩側(cè)DNA雙螺旋的解旋E.coliC/genome=4.2×106bp,40分鐘/每次復(fù)制歷時,10bp/每圈螺旋

84000bp解旋/分(8400rpm!高速離心機)DNAtopoisomeraseIDNA的單鏈瞬間斷裂緩解高速旋轉(zhuǎn)DNAtopoisomeraseIIDNA的雙鏈瞬間斷裂緩解高速解旋時，DNA雙鏈的相互纏繞能量？拓撲異構(gòu)酶（Topoisomerase）

第57頁/共83頁(1)DNA拓撲異構(gòu)酶I100kd

topA編碼不需能量在DNA的一條鏈上產(chǎn)生一個切口。superhelix→D.S.helix第58頁/共83頁(2)DNA拓撲異構(gòu)酶IICutD.S.DNAATPLigategyrαTopII(gyrase)400kdgyrβ

四聚體(ααββ)第59頁/共83頁需要能量使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和連接D.S.helix→superhelix第60頁/共83頁b)DNA聚合酶（DNApolymerase）

polA

polB

dnaEdnaZ

104kd120kd>250kd

monomer

klenowfragmentProkaryote

IIIIII

5’→3’elongation(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+ppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

(68,36)KornbergE

多亞基酶

多亞基酶第61頁/共83頁3’→5’editing

mismatch10-810-3yes

5’→3’exonuclease

smallfragmentrepairNoNo

IIIIII

mutation

lethallethal

功能切除引物，修復(fù)修復(fù)復(fù)制第62頁/共83頁b;primersite

c;primerterminator

a;templatesited;dNTPsite

e;5’→3’repairsite

36kde胰酶68kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNApolymeraseI第63頁/共83頁大片段具有聚合酶和3’→5’的外切核酸酶活性小片段具有5’→3’的外切核酸酶活性第64頁/共83頁多亞基酶功能：不是復(fù)制酶，是修復(fù)酶DNApolymeraseII第65頁/共83頁DNApolymeraseIIIDNApolIII(holoEnzyme)

α+ε+θ→

核心酶α具有5’→3’聚合酶的活性ε

具有3’→5’的外切核酸酶活性β功能如同夾子,夾住模板DNA分子γ是一種依賴DNA的ATP酶第66頁/共83頁c)真核生物DNA復(fù)制的特點及聚合酶●multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.1000-3000bp/min5-300kb/復(fù)制子

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蠅5000replicons受精后genomereplication/3min

Replicons擴增到50,000第67頁/共83頁Euk.染色體在全部復(fù)制完成之前起點不再從新開始復(fù)制。而Prok.

起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物在快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。第68頁/共83頁●DNApolymerase

αδεβγ

polymerize5’→3’均有

NucleiNucleiNucleiNucleimtediting3’→5’

—++—+

功能

RNA引物DNA合成修復(fù)修復(fù)修復(fù)第69頁/共83頁3.8.DNA復(fù)制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控(?!)

第70頁/共83頁a)影響因素

多種專一性的蛋白質(zhì)因子濃度除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA）營養(yǎng)條件（aastarved的抑制)（原核生物）細胞復(fù)制周期速率的影響（真核生物）…b)嚴格的自我調(diào)控機制

e.g.plasmid（parasite）

independentreplication

嚴謹型stringenttype(1-2copies)

松弛型relaxedtype(10-100copies)第71頁/共83頁第72頁/共83頁

Rop蛋白

反義RNA1RNA-2positivecontrol

正調(diào)控0-5550

RNA-2

RNaseHOH

RNA-2復(fù)制的調(diào)控e.g.ColEIplasmid負調(diào)控DNA復(fù)制方向第73頁/共83頁RNA-1110bp

RNaseH不能識別D.S.RNA-1/RNA-2,

不能形成primer

的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNA第74頁/共83頁RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rop

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促進

限制

63aaROP(Ropprotein)

RNA-2

只能轉(zhuǎn)錄到100-220base,

不能到達“0”原點

不能形成primer

的3’-OH0第75頁/共83頁3.9.DNA的甲基化（Methylation）

(m5CinEukaryote)

第76頁/共83頁m5C

a)DNA中m5C的特點

HNH

H4153

62OHNNCH3第77頁/共83頁●m5C的復(fù)制

●m5C的分布

含CG序列HpaIICCmGG