分子生物學(xué)研究法

分子生物學(xué)研究法第1頁(yè)/共58頁(yè)本章主要內(nèi)容一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件二、基因操作的主要技術(shù)原理三、基因克隆的載體系統(tǒng)四、基因的分離與鑒定第2頁(yè)/共58頁(yè)一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；

2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；

3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件第3頁(yè)/共58頁(yè)基因工程的主要內(nèi)容或步驟:

1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。

4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。第4頁(yè)/共58頁(yè)第5頁(yè)/共58頁(yè)二、基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳

將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。

在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。第6頁(yè)/共58頁(yè)第7頁(yè)/共58頁(yè)2．核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地"吸印"轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：

將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過程特稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法

將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸雜交為印跡雜交。第8頁(yè)/共58頁(yè)第9頁(yè)/共58頁(yè)第10頁(yè)/共58頁(yè)第11頁(yè)/共58頁(yè)3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。

對(duì)絕大多數(shù)hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ugDNA可得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。第12頁(yè)/共58頁(yè)4、分子克隆技術(shù)（1）高質(zhì)量mRNA的制備

應(yīng)用PromegaPolyATtractmRNAIsolationSystem分離Poly(A)RNA。將BiotinylatedOligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-BiotinylatedOligo(dT)-mRNA。第13頁(yè)/共58頁(yè)（2）反轉(zhuǎn)錄成cDNA可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA；

應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）；

應(yīng)選用甲基化dCTP；

應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。第14頁(yè)/共58頁(yè)第15頁(yè)/共58頁(yè)(一)、限制性核酸內(nèi)切酶的概念

核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識(shí)別外來的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識(shí)別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會(huì)被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這對(duì)細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來。三.限制性核酸內(nèi)切酶第16頁(yè)/共58頁(yè)

按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。(二)限制性核酸內(nèi)切酶的命名第17頁(yè)/共58頁(yè)按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：

Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶由3種不同亞基構(gòu)成，兼具有修飾酶活性和依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性，它能識(shí)別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，去隨機(jī)切斷在識(shí)別位點(diǎn)以外的DNA序列，通常在識(shí)別位點(diǎn)周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。

Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶

與Ⅰ類酶相似，是多亞蛋白質(zhì)，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點(diǎn)在識(shí)別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。

Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言(三)限制性核酸內(nèi)切酶的分類第18頁(yè)/共58頁(yè)(四)限制性核酸內(nèi)切酶的作用大部分限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3’羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有三種不同的情況：①產(chǎn)生3’突出粘性末端（cohesiveend）:以Eoor為例：

5’…G↓AATTC…3’→5’…Gp

OHTTAAC…3’

3’…CATAA↑G…5’EooPⅠ3'…

CTTAAOH

pG…5'第19頁(yè)/共58頁(yè)②產(chǎn)生5’突出的粘性末端：以PstⅠ為例：

5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp

OHG…3’

3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ3’…GOH

pACGTC…5③產(chǎn)生平末端（bluntend）:NruⅠ為例：

5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGpOHCGA…3’

3’…AGC↑GCT…5’NruⅠ3’…AGCOhpGCT…5’第20頁(yè)/共58頁(yè)DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶酶

主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA特定序列，切斷DNA鏈DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）①缺口平移制作標(biāo)記DNA探針②合成cDNA的第二鏈③填補(bǔ)雙鏈DNA3’凹端④DNA序列分析耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3’末端加入同質(zhì)多聚物尾SI核酸酶，綠豆核酸酶降解單鏈DNA或RNA，使雙鏈DNA突出端變?yōu)槠蕉薉NA端酶Ⅰ降解DNA，在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解除RNA磷酸酶切除核酸末端磷酸基第21頁(yè)/共58頁(yè)四PCR技術(shù)

PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

PCR的基本原理

PCR的種類

PCR的特點(diǎn)

PCR技術(shù)的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)第22頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR(PolymeraseChainreaction)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,故又稱為基因的體外擴(kuò)增法.

可以在試管內(nèi)建立反應(yīng),經(jīng)數(shù)小時(shí)后,就能將極微量的目的基因或特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至數(shù)千萬倍.無須通過煩瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序便可獲得足夠的精確的DNA拷貝,因此有人也將之稱為無細(xì)胞基因克隆法.第23頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR的最早設(shè)想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。(一)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史第24頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR的實(shí)現(xiàn)

但是最初采用的DNA聚合酶是Klenow酶,每輪的變性都會(huì)使之失活,需要補(bǔ)充新酶.隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。第25頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR的改進(jìn)與完善

1988年，Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。第26頁(yè)/共58頁(yè)(二)PCR技術(shù)的基本原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的子鏈.鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。第27頁(yè)/共58頁(yè)解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’模板DNA鏈第28頁(yè)/共58頁(yè)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘引物酶RNA引物引物酶AUCGCG5‘RNA引物第29頁(yè)/共58頁(yè)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’DNA聚合酶AUCGCG5‘ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶第30頁(yè)/共58頁(yè)DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’GGAUCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’AUCGCG5‘ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA的變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火第31頁(yè)/共58頁(yè)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA的變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火第32頁(yè)/共58頁(yè)每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

第33頁(yè)/共58頁(yè)第34頁(yè)/共58頁(yè)第35頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶引物：PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

循環(huán)次數(shù):循環(huán)次數(shù)決定了PCR的擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。第36頁(yè)/共58頁(yè)DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶第37頁(yè)/共58頁(yè)P(yáng)CR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5ul

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

反應(yīng)條件94

℃3min1х94

℃40s56℃40s30x72℃40s72℃5min1x第38頁(yè)/共58頁(yè)(三)PCR的種類1單一PCR檢測(cè)

OriginalDNAPrimerNewDNA變性和合成變性和合成第39頁(yè)/共58頁(yè)例：引物序列actA-F：5’-GCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA-3’actA-R：5’-TTTATGTGGTAATTTGCTGTC-3’PCR擴(kuò)增結(jié)果123（注：其它分離株P(guān)CR結(jié)果與此完全一致）1：100bpDNAladder2：LMSLCC2755PCRproduct3：LM337PCRproduct

820bp第40頁(yè)/共58頁(yè)

巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nPCR)也稱套式PCR。在這種技術(shù)中，首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第一輪PCR，然后再使用第一對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)增，所以稱為巢式PCR。引物設(shè)計(jì)的方法是，巢式PCR兩個(gè)引物的起始點(diǎn)分別從目的基因的5′端堿基序列和3′端的互補(bǔ)堿基序列向中間略有縮進(jìn)；半巢式PCR只是其中的一個(gè)引物縮進(jìn)。在第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物中，能夠產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性是極低的，所以應(yīng)用巢式和半巢式PCR技術(shù)能夠使靶DNA序列得到有效選擇性擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增的靈敏性和特異性。在一定情況下，這種方法對(duì)減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題極為有用，但同時(shí)也增加了每次試驗(yàn)的復(fù)雜性。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約可在第二輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第一輪擴(kuò)增共用，效果也優(yōu)于單次擴(kuò)增。2巢式和半巢式PCR第41頁(yè)/共58頁(yè)巢式和半巢式PCR檢測(cè)第42頁(yè)/共58頁(yè)3多重PCR檢測(cè)

單一PCR的快速、簡(jiǎn)便和敏感是人所共知的，然而它存在的問題包括反應(yīng)失敗所致的假陰性和污染所致的假陽(yáng)性。為了監(jiān)測(cè)PCR的失敗和假象，我們可以在PCR中使用一對(duì)以上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即多重PCR。多重PCR的目的是同時(shí)擴(kuò)增目的DNA中的幾個(gè)片段，以節(jié)省模板DNA、時(shí)間并且減少費(fèi)用.第43頁(yè)/共58頁(yè)多重PCR檢測(cè)PCR擴(kuò)增基因組DNA電泳第44頁(yè)/共58頁(yè)

例:

根據(jù)李斯特菌屬iap基因?qū)俚墓残院头N的特異性設(shè)計(jì)引物,利用三重PCR鑒別各種李斯特菌:引物在基因組中的位置及其序列MonoAUlisALisBUlisA：5’-GCTACAGCTGGGATTGCGT-3’LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAA-3'MonoA：5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3'LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAA-3'HA1： 5’-GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA-3’HA2：5’-GCAACGTATCCTCCAGAGTGATCG-3’HA1HA25‘3‘3‘5‘1250bp750bp420bp第45頁(yè)/共58頁(yè)三重PCR擴(kuò)增結(jié)果1500bp1200bp700bp500bp12345678910111213141.100bpDNALadder；2.LM

(1/2b)；

3.

LM(1/2c)；4.LM(EGD，1/2a)；5.LM(4a)；6.LM(4b)；7.L.innocua；

8.L.ivanovi.；

9.L.grayi；10.L.seeligeri；

11.L.murrayi；12.L.welshimeri；

13.S.typhymuriumTL2；14.S.aureus

750bp420bp1250bp第46頁(yè)/共58頁(yè)4隨機(jī)引物PCR(RAPD)

隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析是采用隨機(jī)選擇的單一引物，通過PCR擴(kuò)增即能產(chǎn)生復(fù)雜的基因組指紋圖譜的一種DNA多態(tài)性分析技術(shù)。該技術(shù)分別由Welsh和Williams于1990年同時(shí)建立。具有自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①使用隨機(jī)引物，合成引物時(shí)無需預(yù)知被研究生物的基因組序列；②造作簡(jiǎn)便快速，避免了其它DNA多態(tài)性分析所需的一系列預(yù)備性工作，如篩選探針、制備克隆、多態(tài)性篩選、同位素標(biāo)記和Southern印跡等；③RAPD分析所需DNA量少，每個(gè)反應(yīng)只需要幾十個(gè)納克的模板DNA；④每個(gè)RAPD標(biāo)志就相當(dāng)于一個(gè)序列位點(diǎn)，因而這種方法可以使基因型的檢測(cè)自動(dòng)化，可以更有效地進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建。第47頁(yè)/共58頁(yè)primerABCRAPD第48頁(yè)/共58頁(yè)5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)PCR(realtimePCR)有時(shí)也稱動(dòng)力學(xué)PCR。最早的實(shí)時(shí)PCR儀是用一臺(tái)熒光計(jì)與一臺(tái)PCR儀相連構(gòu)成，測(cè)量由于熒光染料分子的插入或與雙鏈DNA分子相結(jié)合所導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的不同熒光強(qiáng)度。在PCR的指數(shù)增長(zhǎng)階段，每個(gè)循環(huán)合成產(chǎn)物的產(chǎn)量以一種類似幾何級(jí)數(shù)方式增長(zhǎng)。因此，擴(kuò)增DNA的產(chǎn)量可以通過反應(yīng)管染料中發(fā)射出來熒光的數(shù)量來估算。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)法的高靈敏度，實(shí)時(shí)PCR能夠測(cè)量靶DNA的起始濃度相差在5-6個(gè)數(shù)量級(jí)的大范圍。在應(yīng)用熒光染料如SYBRGreenI時(shí)，可檢測(cè)出起始樣品中拷貝數(shù)為的10-100模板DNA。目前，三種最通用的實(shí)時(shí)PCR儀器是GeneAmp5700序列檢測(cè)系統(tǒng)、ABI光譜7700序列檢測(cè)系統(tǒng)和LightCylcler。實(shí)時(shí)PCR的主要優(yōu)點(diǎn)在于，在一種巨大的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)測(cè)量核酸分子濃度的能力，并且以它的高靈敏度與大容量的并行操作為特征，能同時(shí)檢測(cè)許多樣品。與傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物終點(diǎn)測(cè)量法不同，實(shí)時(shí)PCR提供關(guān)于PCR動(dòng)力學(xué)的瞬間信息；因此，在不同樣品之間擴(kuò)增效率的差異能夠通過計(jì)算獲得補(bǔ)償。第49頁(yè)/共58頁(yè)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)第50頁(yè)/共58頁(yè)(四)PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析