酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測(cè)量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗(yàn)、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。

經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡(jiǎn)單的吸光光度法）是以簡(jiǎn)單離子或分子為檢測(cè)對(duì)象的常量或微量分析，面對(duì)生物體系成分復(fù)雜且待測(cè)物濃度較低的測(cè)試條件則往往無能為力。

于是，一系列針對(duì)生物體系中化學(xué)成分的測(cè)量方法應(yīng)運(yùn)而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識(shí)與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點(diǎn)ELISA的應(yīng)用實(shí)例第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。

第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六一、基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六（三）競(jìng)爭(zhēng)法

此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六用已知特異性抗體包被固相載體測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六特點(diǎn)一：靈敏性該測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告集團(tuán)的酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml。

第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六特點(diǎn)二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六ELISA應(yīng)用實(shí)例第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測(cè)：第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六ELISA檢測(cè)“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測(cè)幽門螺桿菌抗體第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六ELISA試劑盒商業(yè)資訊第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六ELISA試劑盒第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫井第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六DNM-9602G酶標(biāo)分析儀DNM-9602