DB33∕T 2333-2021 飼料中β-胡蘿卜素的測(cè)定 高效液相色譜法

ICS

65.020.01CCS

B

20

DB33浙 江 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB33/T

2333—2021飼料中

β-胡蘿卜素的測(cè)定高效液相色譜法

β-carotene

in

feeds—High

liquid

浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB33/T

2333—2021本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（ZJQS/TC33）歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所）。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：施杏芬、呂偉軍、阮鑫、張志健、裘丞軍、吳望君、商小金。IIDB33/T

2333—2021

1 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中β-胡蘿卜素的高效液相色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料中β-胡蘿卜素的測(cè)定。1

mg/kg2

mg/kg。2規(guī)范性引用文件標(biāo)準(zhǔn)。GB/T

6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

20195動(dòng)物飼料

試樣的制備3 術(shù)語和定義本標(biāo)準(zhǔn)沒有需要界定的術(shù)語和定義。4 試樣中β--高效液相色譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量。5

試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1 水：GB/T

6682-2008，一級(jí)。5.2 甲醇：色譜純。5.3 異丙醇：色譜純。5.4 二氯甲烷：色譜純。5.5 石油醚（沸程60℃）。5.6 正己烷。5.7 無水硫酸鈉。5.8 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA5.9

二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）。5.10 L-抗壞血酸乙醇溶液：稱取L-抗壞血酸0.5

g，加4

水加熱溶解，用無水乙醇稀釋至100

mL混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。5.11 50%氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀50

g，加水

mL溶解，混勻。DB33/T

2333—20215.12飽和氯化鈉溶液：先將燒杯中的水煮沸，向沸水中邊攪拌邊加入氯化鈉，直到有固體顆粒析出，將此溶液冷卻至室溫。5.13

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（500

μg/mL）：稱取全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：7235-40-7，純度不低于95%）

mg（精確至0.01

mg）至

mL棕色容量瓶中，加入10

二氯甲烷（5.4）溶解，用二氯甲烷（5.4）稀釋并定容至刻度，混勻，每次臨用前按附錄A標(biāo)定。℃保存，有效期2個(gè)月。5.14 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（

μg/mL）：精確移取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（）10.0

于

mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷（5.4）稀釋并定容。于4℃保存，有效期為1周。5.15 β-5.14

mLμg/mL、0.50

μg/mL、1.00

μg/mL、2.50

μg/mL、5.00

μg/mL、10.00

μg/mL。臨用現(xiàn)配。5.16 微孔濾膜：0.45

μm，有機(jī)系。6 儀器設(shè)備6.1

高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器/二極管陣列檢測(cè)器。6.2

分析天平：感量分別為0.001

g和0.01

mg。6.3

超聲波清洗器。6.4

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.5

旋渦儀。6.6

分光光度計(jì)。7 按GB/T

20195制備試樣，至少

g，粉碎使其全部通過0.42

mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨口瓶中，避光保存，備用。8 試驗(yàn)步驟警示——應(yīng)避光操作！8.1 皂化2

g～5

g或添加劑預(yù)混合飼料

g～1

g，精確至0.001

g，置于250

mL具塞棕色三角瓶，加入

EDTA

（5.8）1

g，邊搖邊加入L-醇溶液（5.10）50

mL使試樣完全分散、浸濕，加入

mL

50%氫氧化鉀溶液（），混勻，℃水浴加熱超聲皂化20

min，不時(shí)振蕩防止試樣粘附在瓶底和瓶壁上，皂化結(jié)束后取出迅速冷卻至室溫。8.2 提取將皂化液轉(zhuǎn)移至盛有

80

石油醚（5.5）的

分液漏斗中，用

30

mL～50

mL

水分

2

3加入

mL

100

）

（

5.5）定容，搖勻。8.3濃縮DB33/T

2333—2021從石油醚提取液（V）分取一定體積（V1）于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶中，置于

402℃減壓濃

5.00mL（V2-胡蘿卜素

10

μg

0.45μm

濾膜（）過濾備用。8.4 測(cè)定8.4.1

色譜條件8.4.1.1

色譜柱：18柱，柱長

mm，內(nèi)徑

mm，粒徑

μm，或性能相當(dāng)者。8.4.1.2

流動(dòng)相：甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3。8.4.1.3

流速：1.5

。8.4.1.4

柱溫：30℃。8.4.1.5

進(jìn)樣量：

μL。8.4.1.6

檢測(cè)波長：450

nm。8.4.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定8.3-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄Ｂ。8.4.3 -胡蘿卜素保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中β-胡蘿卜素的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5％之內(nèi)。8.4.4 以β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.999。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中β-胡蘿卜素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)將試樣提取液用流動(dòng)相稀釋（稀釋倍數(shù)n）至線性范圍內(nèi)，重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中β-胡蘿卜素的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過。9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理9.1

試樣中

β-12W

C

2

1000V1m1000

n……………………（1）式中:-胡蘿卜素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C

——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中β-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mLV

——試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mLV1

——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mLV2

——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；m

——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；n

——超出線性范圍后，需要進(jìn)一步稀釋的倍數(shù)。DB33/T

2333—2021W

Cs

2

1000As

V1m1000

n

……………（2）式中：-胡蘿卜素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；A

——試樣溶液中β-胡蘿卜素的峰面積；AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中β-胡蘿卜素的峰面積；CS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中β-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V

——試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mLV1

——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mLV2

——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；m

——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；n

——超出線性范圍后，需要進(jìn)一步稀釋的倍數(shù)。9.2

結(jié)果的表示測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10 精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的10%。DB33/T

2333—2021附

錄 A（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度標(biāo)定方法取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(濃度約為500

μg/mL)10

μL,注入含

mL正己烷（5.6）的比色皿中,混勻。比色皿厚度為1

cm,以正己烷（5.6）為空白,用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，入射光波長為

nm,其吸光度值,平行測(cè)定3次，取均值。溶液濃度按式(A.1):X

3.01E

0.01

………………（）X β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL)；A β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)