《基因組學(xué)》第03章 物理圖繪制

第3章物理圖繪制什么是基因組物理圖?Physicalmap:采用非遺傳重組的方法以DNA堿基順序?yàn)閳D距單位繪制的位于染色體上基因線性排列次序的圖譜.Amapofthelinearorderofgenesonachromosomewithunitsindicatingtheirdistancesdeterminedbymethodsotherthangeneticrecombination.見：維基百科物理圖的類別1)限制性酶切位點(diǎn)物理圖2)克隆疊連群物理圖3)染色體熒光標(biāo)記原位雜交物理圖4)STS分子標(biāo)記物理圖物理圖的作圖方法1）限制性作圖（Restrictionmapping）它是將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對(duì)位置。2）依靠克隆的基因組作圖(Clone-basedmapping)

根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建疊連群

(Contig)繪制物理連鎖圖。3）熒光標(biāo)記原位雜交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）將熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交確定分子標(biāo)記的所在位置。4）順序標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequencetaggedsite,STS）作圖

通過PCR或分子雜交將小段單拷貝DNA順序定位在染色體區(qū)段中。限制性作圖---

（Restrictionmapping）

1)通過實(shí)驗(yàn)將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在

DNA分子的相對(duì)位置.2)根據(jù)DNA順序計(jì)算機(jī)標(biāo)示電子酶切位點(diǎn)物理圖.限制性作圖—小分子DNADNA分子電子酶切物理圖16621cgatgtccatgaaggcgagtgcggagcctactccgcctcacgcaccttggttggcaaggc16681ctttcgtcagggtttctattggctgacggctcttaacgacgcggtcgacctggtccggcg16741gtgcagggcgtgccagttccacgccaggcaaacccatcagccggcccaggccctgcagac16801catacctctttcgtggccgtttgctgtctgggggctcgatatcctgggtccgttcaggcg16861ggccccgggcgggttcgagtatctgtatgtcgctgtcgacaagttcactaagtggcccga16921ggcttatccggtcatcaagatcgataagcactccgcgcttaaattcatcagaggcatcac

注:紅色標(biāo)示的為水稻BAC克隆AP007224SalI酶切位點(diǎn).如果DNA順序是已知的,可以通過計(jì)算機(jī)軟件搜尋DNA順序中不同限制酶酶切位點(diǎn)繪制DNA分子限制性物理圖.大分子DNA物理圖繪制大分子DNA的研究策略與方法1)什么是大分子DNA:百萬堿基對(duì),Mb2)大分子DNA研究的面臨的問題:

易斷裂,難分離,難克隆3)大分子DNA的研究方法:1.制備---瓊脂糖包埋法

2.酶切---稀有酶切位點(diǎn)限制酶

3.分離---脈沖電泳分離

4.克隆---載體設(shè)計(jì)

稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1)什么是稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶:在基因組DNA順序中只有很少可識(shí)別序列的限制酶,一般識(shí)別位點(diǎn)在6-8堿基對(duì)之間,并含有高G/C比.2)選用稀有切點(diǎn)限制酶注意事項(xiàng):a)識(shí)別位點(diǎn)的非特異順序,-GANTC-(HinfI),-GCCNNNNNGCC-(BglI)b)高等生物基因組一般A/T比較高,應(yīng)選G/C

高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因組甲基化狀態(tài),高等生物基因組DNA甲基化比例很高,但果蠅和酵母基因組無甲基化稀有切點(diǎn)限制酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名規(guī)則1)限制性核酸內(nèi)切酶主要是從原核生物中提取的。通用的命名規(guī)則是：第一個(gè)字母是細(xì)菌屬名的首字母，斜體大寫.第二、三個(gè)字母是細(xì)菌種名的前二個(gè)字母，斜體小寫.接下去是細(xì)菌株的第一個(gè)字母，用正體字母書寫。如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……來代表。2)例子:大分子DNA的分離技術(shù)脈沖交變電場電泳均一脈沖電場電泳采用大分子DNA技術(shù)繪制E.coli基因組物理圖大腸桿菌基因組物理圖繪制大腸桿菌基因組遺傳圖大腸桿菌基因組

遺傳圖

與

物理圖

整合克隆作圖---大分子DNA的克隆根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建疊連群(Contig),繪制物理連鎖圖。大分子DNA克隆載體1)大分子DNA克隆載體:YAC,BAC,PAC,HAC,MAC,TAC

優(yōu)缺點(diǎn):2)大分子DNA克隆的作圖:

步移法指紋法

酵

母

人

工

染

色

YACYAC載體與Olson細(xì)

菌

人

工

染

色

體

BAC噬菌體人工染色體

PACYAC和BAC基因組文庫的構(gòu)建1)目標(biāo)基因組大分子DNA的制備

2)載體制備

3)載體和插入DNA的連接

4)轉(zhuǎn)化

5)轉(zhuǎn)化子鑒定

目標(biāo)基因組大分子DNA的制備1)動(dòng)物細(xì)胞:

樣品洗滌→低溶點(diǎn)瓊脂糖包埋→蛋白酶消化→洗滌→限制酶部分酶解2)植物細(xì)胞:

樣品(葉片)→洗滌吸干水分→液氮冷凍→碾碎→離心收集細(xì)胞核→低融點(diǎn)瓊脂糖包埋→蛋白酶消化→洗滌→限制酶部分酶解

部分酶解制備大分子DNA片段1)低融點(diǎn)瓊脂糖包埋:

薄片法,微粒法2)酶解:3)選擇限制酶,緩沖液,酶濃度,酶解時(shí)間4)加入0.5EDTA溶液終止酶解

瓊脂糖包埋法1)分離純化細(xì)胞核2)將收集的細(xì)胞核包埋在瓊脂糖凝膠薄片中3)蛋白酶消化處理細(xì)胞核酶切大分子DNA的分離載體制備與插入DNA連接1)YAC載體制備過程與一般質(zhì)粒載體相同2)BAC載體低拷貝載體,大量制備,超離心純化3)酶切釋放接頭,接頭去磷,減少自連4)連接(方法1)

將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片與載體混合,按重量比1:1.680C保溫5min,降溫至370C,加入連接酶過夜.5)連接(方法2)

將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片680C保溫5min,降溫至370C,加入agarase消化.然后取出部分DNA樣品,按重量比1:1加入載體,加入連接酶過夜.除去未連接載體YAC轉(zhuǎn)化1)酵母原質(zhì)體的制備采用蝸牛酶(lyticase)處理酵母細(xì)胞脫壁,酵母原質(zhì)體保溫在滲透壓緩沖液中.2)轉(zhuǎn)化酵母原質(zhì)體加入YAC連接載體,200C保溫過夜.3)篩選培養(yǎng)基酵母基本培養(yǎng)基,缺少URA,色氨酸和腺苷酸.4)鋪板將轉(zhuǎn)化處理的酵母原質(zhì)體懸浮在滲透壓選擇液化培養(yǎng)基中迅速鋪板.5)300C培養(yǎng)4-5天,出現(xiàn)白色克隆為陽性克隆.YAC克隆檢測---大分子DNA

Southern雜交YAC克隆的優(yōu)缺點(diǎn)1)優(yōu)點(diǎn):容量大,插入片段可達(dá)1000kb.2)缺點(diǎn):轉(zhuǎn)化效率低.

嵌合克隆比例高,達(dá)48%.

克隆DNA的制備困難.3）上世紀(jì)90代初該克隆體系被放棄。BAC克隆—主流大分子DNA克隆技術(shù)1)載體與插入大分子DAN的連接:

將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片680C保溫5min,降溫至370C,加入agarase消化.然后取出部分DNA樣品,按重量比1:1加入載體,加入連接酶過夜2)宿主菌制備:選定的宿主菌在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)至光密度0.2,收集細(xì)菌.3)將細(xì)菌密度調(diào)整到109,加入連接反應(yīng)液,轉(zhuǎn)移到電擊杯(0.1cm直徑)中.電擊轉(zhuǎn)化參數(shù):25000V/cm.4)氯霉素選擇培養(yǎng)基上篩選陽性克隆,陽性克隆白色.疊連群構(gòu)建將彼此順序重疊的大分子DNA克隆依次排列組建疊連群,繪制由大分子DNA克隆組成的物理圖,方法如下:1)染色體步移法(chromosomalworking)2)指紋重疊法染色體步移

指紋作圖—3種指紋限制性片段指紋作圖原理指紋作圖的目的有二:對(duì)大分子DNA克隆進(jìn)行排序.2)選擇最適合測序的DNA克隆.限制性片段指紋電泳圖指紋重疊群構(gòu)建酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合順序標(biāo)簽位點(diǎn)作圖

（Sequencetaggedsite,STSmapping）

通過PCR或分子雜交將特定DNA

順序定位在基因組染色體區(qū)段中。STS作圖原理

輻射雜種作圖

輻射雜種圖距單位DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射線劑量下兩個(gè)分子標(biāo)記之間發(fā)生1%斷裂的機(jī)率,其圖距單位為厘鐳(centiRay,cR).輻射雜種連鎖分析人類21號(hào)染色體輻射雜種圖一段人類染色體DNA的輻射雜種圖人類基因組輻射雜種圖距染色體物理長度（Mb）cM/cRkb/cR平均滯留率（范圍）————————————————————————————————

12630.2019721.1(14.3-50.6)22550.2122523.8(14.3-37.5)32140.2723326.9(14.3-41.1)42030.2825624.3(11.3-44.0)51940.2927226.9(17.3-49.4)61830.2424330.6(21.4-49.4)71710.2322927.7(19.0-44.6)81550.2627131.0(31.0-45.8)91450.3830522.1(14.3-27.4)101440.2625328.5(16.2-56.3)111440.3027025.7(20.2-38.7)121430.2123432.1(23.2-50.6)13q980.2217922.9(16.7-36.3)14q930.3420832.0(21.1-57.1)15q890.3620331.7(24.4-45.2)16980.4320130.5(21.6-39.9)17920.2314761.6(33.9-93.5)18850.3017234.3(20.7-43.5)19670.2011032.2(21.4-45.8)20720.3019131.0(16.1-41.1)21q390.3115150.1(39.3-71.3)22q430.9518536.6(30.4-50.6)X164