引物設(shè)計(jì)大全

primerpremierprimerexpress為輔〔針對探針OligoBLAST隨時(shí)檢驗(yàn)PCR引物設(shè)計(jì)原則PCRDNAPCR區(qū)域單鏈能形成二級構(gòu)造，就要避開它。如這一段不能形成二級構(gòu)造，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。15～30100～600P1G+C40%～60%。而且四種堿基的分布最好隨P1同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。5′熒光素、地高辛等，這對擴(kuò)增的特異性影響不大。但3′端確定不能進(jìn)展任何修飾，由于引物的延長是3′33影響擴(kuò)增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則：①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級構(gòu)造。15～30④G+C40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4⑦引物之間不能有連續(xù)4⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不行修飾。3′3PCRDNAPCR但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。避開產(chǎn)物的二級構(gòu)造區(qū)mRNA〔△G°〕58.6lkJ/mol7-deaza-2′-脫氧GTPdGTP長度15～30bp，20～27mer。引物的有效長度：Ln=2〔G+C〕+〔A+T〕，Ln38，由于>38TaqDNA〔74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。G+CG+C40%～60%。其Tm50%寡核苷酸雙鏈TmTm55～80℃，Tm72℃以使復(fù)性條件最正確。堿根底隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的GC，G+C引物自身3bp。引物之間3′4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物的3′端3′3′PCR〔AS-PCR〕3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。dNTP〔dNTP200μmol/L〕以質(zhì)?！?03〕95℃，25s；55℃，25s；72℃，1minHIV-1gag1/100A：GG：APCR引物的5′端5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。密碼子的簡并33特異性與效率。寡核苷酸的優(yōu)化設(shè)計(jì)估測可能形成的DNARNADNARNA在一個(gè)雙鏈構(gòu)造中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基打算的。在熱動力學(xué)中，這樣的性質(zhì)以雙鏈形數(shù)值(自由能)來推測雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡化起見，全部的計(jì)算都在25℃的相鄰核苷酸的自由能是：第一個(gè)(5′)核苷酸其次個(gè)核苷酸dA dC dG dTdA－1.9－1.3－1.6－1.5dC－1.9－3.1－3.6－1.6dG－1.6－3.1－3.1－1.3dT－1.0－1.6－1.9－1.9 ΔG(kcal/mol)d(ACGG／CCGTΔGΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0kcal/mol3′末端會形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來計(jì)算發(fā)夾環(huán)構(gòu)造的5.2kcal/mol；44.5；54.4；64.3；784.1kcal／mo1。選擇引物的一般規(guī)章設(shè)計(jì)和選擇引物時(shí)有5個(gè)要素必需留意。3′末端不互補(bǔ)3′末端不互補(bǔ)物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產(chǎn)物，極大地削減所期望產(chǎn)物的得量。有試驗(yàn)說明，3′末端雙鏈的ΔG0～－2kcal/molPCR產(chǎn)量漸漸下降，在－640%，到－820%，而－100。雖然產(chǎn)量還取決于其他Taq3′3′末端雙鏈的穩(wěn)定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時(shí)產(chǎn)量對二聚體的形成就有很大的依靠性。引物分子內(nèi)不互補(bǔ)應(yīng)當(dāng)盡量不用會通過釋放能量而形成分子內(nèi)雙鏈構(gòu)造的寡核苷酸。雖然有ΔG3kcal/mol3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延長反響，削減了參與正式反響引物的數(shù)量。固然，5′末端對反響就沒有多大的影響了。普遍認(rèn)為PCR引物應(yīng)當(dāng)有50%的GC/AT81%AT250bp70%AT完全沒有必要簡單地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCRGC/ATGC/AT要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。由于DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的爭論者寵愛設(shè)計(jì)很長，而不求它很穩(wěn)定的引物?？墒?，引物太長就難以避開形成二聚體和自身互補(bǔ)，因此，一般還是不用為好。假設(shè)期盼的產(chǎn)物長度等mer引物得到40kb的產(chǎn)物。但是，引物較長時(shí)，假設(shè)不借助引物選擇的計(jì)算機(jī)軟件幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補(bǔ)性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時(shí)就會使引物彼此引發(fā)而不是延長模板，得出非專一產(chǎn)物。通過下述的觀看內(nèi)部穩(wěn)定性原理可以極大地削減這種問題。引物的內(nèi)部穩(wěn)定性DNAPCR5′GC3′末端不引物的內(nèi)部穩(wěn)定性AT3′3′末端DNA此，為了有效地引發(fā)反響，引物的5′DNA的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其全部的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點(diǎn)的結(jié)實(shí)協(xié)作就可以引發(fā)反響，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。3′末端低穩(wěn)定性的引物，反響的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的PCR性、Tm、產(chǎn)物長度)和退火的溫度與時(shí)間。3′末端穩(wěn)定的引物也可以滿足地進(jìn)展反響。但是，無論如何，寡核苷酸3′53′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。引物的唯一性為了放大單個(gè)的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一的，即在模引物的唯一性板中沒有重復(fù)序列。雖然不會整個(gè)引物序列都偏好于和模板中的一個(gè)以上位點(diǎn)匹配，但是，通常見到DNAPCR假設(shè)用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來核對想用的引物的互補(bǔ)性。由此也可知，應(yīng)當(dāng)避開使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(fù)(如—ATATAT—)。依據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸3.依據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸個(gè)蛋白質(zhì)的基因時(shí)。此時(shí)要留意的問題有：寧可用簡并引物，也不用猜測的引物。氨基酸密碼子的簡并性賜予引物設(shè)計(jì)以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1024個(gè)簡并引物得到很好的結(jié)果。但是，應(yīng)當(dāng)避開在一個(gè)區(qū)域內(nèi)有很高的簡并性。但也有簡并性低使引物不工作的報(bào)道。15%～20%的錯(cuò)配，PCR3′5′末端錯(cuò)配會引起更嚴(yán)峻的問題。42PCR，3′末端0.8mmol/L3′末端錯(cuò)配引物可以承受，雖然非專一產(chǎn)物比較多，DNA合成，因此，在開頭的PCR3～5酸能夠產(chǎn)生質(zhì)量更好的所求產(chǎn)物。在用唯一性引物時(shí)，建議用0.2mmol/L或更低的總核苷酸濃度，由于高濃度會增加錯(cuò)誤參入的比率。1～3μmol/L0.2μmol/L，由于在反響混合物中的大多數(shù)寡聚物并不是被用來引發(fā)專一的反響，而只是產(chǎn)生高的背景而已。oligofileopen或點(diǎn)擊“翻開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl＋O”可翻開下面的窗口在特地的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”O(jiān)ligo5.0ΔG圖；Oligo6.0Frq“Oligo”的功能比“Premier”fileopen或點(diǎn)擊“翻開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl＋O”可翻開下面的窗口OPENFreqSeq再點(diǎn)“翻開”drosfr或者其它一個(gè)文件點(diǎn)擊“翻開”消滅以下窗口，點(diǎn)擊“window”再點(diǎn)擊“Tile”Tm、ΔGFrq，F(xiàn)rq6.06至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。由于分析要涉及多個(gè)指標(biāo)，起動窗口的cascade排列方式不太便利，可從windows菜單改為tile方式。Frq，Oligo5.0，只是顯示更清楚了。5’3’〔圖：〕Tm72℃四周為佳，5’3’的下降外形也有利于引物引發(fā)聚合反響。Frq3’Frq值相對較低的片段。Search“Fo”rPrimersandprobes”F3消滅以下窗口，點(diǎn)OK就OK了。固然你也可以點(diǎn)擊“Prameters”和“SearchRange”選擇你要的參數(shù)和你上下游引物的位置及你擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。SearchStatus“OK”GC點(diǎn)擊任一行消滅“PCR”窗口，告知你擴(kuò)增片斷的位置，最適宜的退火溫度等等信息。關(guān)掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原來的窗口你就能看到你引物的序列和位置，圖中手型鼠標(biāo)所指即為引物序列。至此引物設(shè)計(jì)已經(jīng)完成，你可以用“Analyse”菜單分析你的引物：有無引物二聚體、發(fā)卡構(gòu)造等等。當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對引物進(jìn)展評價(jià)并依據(jù)評價(jià)對引物進(jìn)展修改。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要留意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成〔crossdimer〕。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測〔非克隆〕性PCR，對引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。其次項(xiàng)檢查是發(fā)夾構(gòu)造〔hairpin〕；與二聚體一樣，發(fā)夾構(gòu)造的能值越低越好。一般來說，這兩項(xiàng)構(gòu)造的能值以不超過4.5為好。固然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必定存在發(fā)夾構(gòu)造，而且能值不會太低。這種PCR需要通過敏捷調(diào)控退火溫度以到達(dá)最好效果，對引物的發(fā)夾構(gòu)造的檢測就不應(yīng)要求太高第三項(xiàng)檢查為GC含量以45-55％為宜有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被掌握在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。 感謝各位！〔完〕PrimerPremier5速成FILE---NEW—DNASEQUENCE如下圖。ctrl+VN以備后續(xù)設(shè)計(jì)時(shí)加酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，如下圖。enzyme圖標(biāo)，將所選質(zhì)粒上的多克隆酶切位點(diǎn)參加左欄選中OK鍵，分析目的基因中所含的酶切位點(diǎn)，選插入位點(diǎn)時(shí)就應(yīng)排解這些酶S圖標(biāo)，editprimer,開頭設(shè)計(jì)正義鏈。軟件默認(rèn)引物為二五個(gè)堿基可將鼠標(biāo)點(diǎn)在設(shè)計(jì)框的3端從右向左刪除7－9個(gè)堿基，保存16－18個(gè)配對即可3HINDIII酶切位TTAanalyzeOK。EDITPRIMERS圖標(biāo)，開頭設(shè)計(jì)反義鏈。37－9個(gè)堿基同正義鏈。將酶切位點(diǎn)加在5端，應(yīng)將產(chǎn)品名目所示的酶切位點(diǎn)序列從右至左參加〔留意不要加反〕BamHICGC3