數(shù)字PCR 技術(shù)大盤點

2/2數(shù)字PCR大盤點數(shù)字PCR技術(shù)原理數(shù)字PCR技術(shù)被很多人稱為“第三代”PCR技術(shù)，不同于qPCR，數(shù)字PCR將稀釋后的反應(yīng)體系分散成數(shù)萬個微小獨立反應(yīng)體系（微液滴），并對微液滴反應(yīng)體系進行分隔（Partition）的操作，每個反應(yīng)微液滴包含零、一種或僅僅數(shù)種DNA分子，擴增完成后對所有的微液滴進行熒光信號識別并計數(shù)，以此計算出陰性和陽性反應(yīng)的數(shù)量，根據(jù)相對比例和微液滴的體積，通過泊松分布原理計算靶標(biāo)分子的濃度，從而實現(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對定量。數(shù)字PCR結(jié)果判定不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且不受PCR擴增效率影響，具有比qPCR更高的靈敏度、準(zhǔn)確度以及重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。泊松分布原理及公式數(shù)字PCR的發(fā)展史1988年，CetusCorporation首次發(fā)表數(shù)字PCR的方法，當(dāng)時研究人員通過將樣品分開，某些反應(yīng)包含目標(biāo)分子，而另一些則不包含，證明可以通過PCR檢測和擴增單個β-珠蛋白分子。1990年，PeterSimmonds和AJBrown首次使用此概念對分子進行量化。1992年，AlexMorley和PamelaSykes正式建立了該方法作為核酸的定量技術(shù)。1999年，BertVogelstein等人在美國科學(xué)院院刊PNAS上首次提出了數(shù)字PCR（DigitalPCR,dPCR）的概念，并表明該技術(shù)可用于研究罕見的癌癥突變。2003年，Kinzler和BertVogelstein繼續(xù)完善dPCR，并創(chuàng)建了一種改進的方法，他們將其稱為BEAMing技術(shù)，即“珠子，乳狀液，擴增和磁性”的首字母縮寫。BEAMing技術(shù)使用乳狀液在單個試管中分隔擴增反應(yīng)。這一變化能在一次運行中將該PCR擴展到成千上萬的反應(yīng)。再往后，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabricationandmicrofluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)逐漸突破瓶頸，快速發(fā)展。數(shù)字PCR技術(shù)流分類目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統(tǒng)。微液滴制備的方法，目前主流的有四種：1）芯片微孔物理分割法，俗稱物理分隔法，代表公司有Fluidgm,Qiagen,Roche，ThermoFisher,；2）液滴分割法,俗稱油包水，代表公司有Bio-Rad；3）雜交式芯片液滴法，代表公司有Stilla；4）注射振動制滴法，算是國內(nèi)首創(chuàng)。PS：芯片式物理分割技術(shù)專利（US006143496A）已經(jīng)過期，目前有不少公司在這個技術(shù)的基礎(chǔ)上進行開發(fā)，例如羅氏。數(shù)字PCR通俗分類及特點國外數(shù)字PCR盤點（一）BiomarkHD（Fluidigm）2006年，商業(yè)數(shù)字PCR“鼻祖”，美國Fluidigm公司推出了第一臺商業(yè)化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)BiomarkHD，F(xiàn)luidigm的IFC(integratedfluidiccircuits)是一個納米流體生物芯片，使用物理矩陣的策略，可以用分離的單個DNA模板分子進行數(shù)字PCR反應(yīng)，該芯片包含一個流體管線、NanoFlex?閥門和腔室的網(wǎng)絡(luò)。BiomarkHD系統(tǒng)integratedfluidiccircuits芯片QX200（伯樂）2011年，美國伯樂（Bio-Rad）公司正式將美國QuantaLife公司收入麾下，將QuantaLife油包水微滴生成技術(shù)數(shù)字PCR更名為QX100，推向市場。QX100dPCR利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析。2013年，日后成為經(jīng)典的QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)問世。QX200整個系統(tǒng)包含4臺設(shè)備，一臺配套的液滴生成儀，一臺配套滴液信號讀取分析儀，一臺通用型的PCR熱循環(huán)儀，和一臺PCR96孔板封膜儀。大致的流程是：液滴生成儀通過油包水的方式，在2分鐘生成20,000個油包水微微滴，在普通PCR儀上擴增，最后通過微滴信號讀取分析儀讀取所有微滴的熒光信號。PS：雖然郎中象覺得操作有點復(fù)雜，但并不影響QX200在全球市場上攻城略地。RainDrop（伯樂）2012年RainDance公司推出了RainDrop數(shù)字PCR儀，RainDrop數(shù)字PCR系統(tǒng)包含3臺設(shè)備，一臺Thunderbolts液滴生成儀、一臺通用型PCR熱循環(huán)儀（PCRthermalcycler）、一臺Sense液滴信號讀取分析設(shè)備。Raindrop數(shù)字PCR能夠提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品，這個設(shè)備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺。在空氣壓力驅(qū)動下，Thunderbolts將每個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1,000萬（50微升）個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液。由于Raindrop采用流式細胞儀讀取法分析，據(jù)說讀完百萬量級液滴需要近10個小時，而且一次實驗需要兩張芯片。由于芯片太過復(fù)雜，導(dǎo)致RainDrop系統(tǒng)很費錢，賣得也不好。2017年，RainDance公司被Bio-Rad收入囊中。QXONE（伯樂）2020年，Bio-Rad正式發(fā)布數(shù)字PCR一體機系統(tǒng)——QXONE，該系統(tǒng)無縫集成了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取分析等步驟，配備4個獨立的熒光檢測通道，可以在單反應(yīng)孔中實現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異（CNV）檢測、5重突變檢測或4重基因表達檢測。全自動無人值守的QXONE，一天內(nèi)可以完成多至5塊反應(yīng)板（480個反應(yīng)）的數(shù)字PCR實驗及分析。Continuum（伯樂）Dropwork公司位于科羅拉多州，一家典型的小微公司，數(shù)字PCR產(chǎn)品叫Continuum，沒有看到上市，產(chǎn)品外觀圖如下（老外的產(chǎn)品造型總是那么拉風(fēng)）Continuum系統(tǒng)Dropwork數(shù)字PCR系統(tǒng)Continuum的加熱方式有點特別，Dropwork公司拿到了亞利桑那州立大學(xué)的“連續(xù)流空間熱循環(huán)”專利授權(quán)，并把它用在了Continuum上。連續(xù)流空間熱循環(huán)技術(shù)原理將加熱模塊拼接成圓筒狀，圓筒不同的扇區(qū)設(shè)置不同的恒定溫度，將細長管以包裹的形式纏繞圓筒，液滴在細長管中，被油相裹挾著一圈圈環(huán)繞流經(jīng)兩個扇形溫區(qū)，完成擴增。該系統(tǒng)屬于典型的連續(xù)流數(shù)字PCR，所以樣品是按順序裝載和處理的。連續(xù)流動的空間熱循環(huán)方法使每個液滴和每個擴增循環(huán)都有一致的受熱溫度。Continuum也是一個集成儀器，因為分割30,000個液滴→熱循環(huán)擴增→結(jié)果分析都在同一臺儀器中完成。Continuum具有四色檢測通道，處理一個檢測需要四個多小時。2021年，Bio-Rad將Dropwork公司攬入懷中。今年上半年，伯樂推出新款QX600微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（ddPCR?），設(shè)備外觀和機理與QX200一致，配置六色（FAM、HEX、Cy5、Cy5.5、ROX和ATTO590）檢測通道，單孔中可定量12個靶標(biāo)，檢測試劑和耗材也與QX200完全兼容。參考資料：/s?__biz=MzI5MjUxMTY0OA==&mid=2247536244&idx=1&sn=8b6e8ae95991bd0a7c23c67ced63e723&chksm=ec0244bbdb75cdadb694dcf01f7ae2e0fd5950ba1280fcc7a6ccfed0ea393101835ede68cf85&scene=27上一篇介紹了數(shù)字PCR原理和發(fā)展史，以及伯樂的數(shù)字PCR產(chǎn)品，呈現(xiàn)了伯樂在數(shù)字PCR領(lǐng)域的豪橫發(fā)跡史。IVD業(yè)界對于數(shù)字PCR的應(yīng)用前景，充滿著不小的爭議，很多朋友對“第三代PCR技術(shù)”的說法嗤之以鼻，qPCR和數(shù)字PCR的代差爭議，后面再講。雖然有爭議，但不可否認的是，行業(yè)頭部企業(yè)們，都在紛紛跟進布局。相較于實時熒光定量PCR，數(shù)字PCR的優(yōu)勢在于●高靈敏度，可實現(xiàn)單分子級檢測數(shù)字PCR本質(zhì)上將一個傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)變成了數(shù)萬個PCR反應(yīng)，在這數(shù)萬個反應(yīng)單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。●高精度，可檢測微小差異數(shù)字PCR技術(shù)能從復(fù)雜背景序列中檢測低豐度目的序列，在大量野生型基因存在的情況下精準(zhǔn)地檢測低含量的突變基因?！窠^對定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線數(shù)字PCR直接計算目的序列的拷貝數(shù)，無需依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。●高重復(fù)性，受擴增效率偏差影響小FAM、HEX和Cy5通道濃度平均值和CV值的數(shù)據(jù)表明，在所述的實驗條件下，三種測試濃度之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(p<0.05)?！駨娔褪芤种莆?，更適用于多種性復(fù)雜樣本數(shù)字PCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)勢，使其特別適合于土壤、血液、食品等復(fù)雜樣本中基因表達的準(zhǔn)確定量檢測。有優(yōu)勢就有劣勢，數(shù)字PCR目前普遍設(shè)備成本高、通量小、耗材復(fù)雜、使用成本高、檢測范圍較窄。市面上部分dPCR液滴生成、擴增、檢測分別在不同儀器中完成，操作繁瑣，增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性和交叉污染風(fēng)險。國外數(shù)字PCR盤點（二）QuantStudio3D（賽默飛世爾）2013年4月，賽默飛世爾（ThermoFisher）以136億美元收購LifeTechnologies。同年年6月，賽默飛世爾正式推出QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。IVD智造，贊1QuantStudio3D數(shù)字PCR平臺采用的是硅基材料納升微孔板芯片物理分割技術(shù)，其基本的檢測流程是：將PCR反應(yīng)混合物加入到涂布器中，通過涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在有20,000個微孔的芯片上，將芯片放在PCR熱循環(huán)儀上擴增，最后將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號。整個過程在封閉的芯片中進行，樣本之間保持完全隔離，可以有效防止樣品交叉污染，減少移液過程。同時芯片式設(shè)計避免了微滴式系統(tǒng)可面臨的管路堵塞問題。但是，操作流程太復(fù)雜了。QuantStudioAbsoluteQ（賽默飛世爾）ThermoFisher2021年收購Combinati公司，緊接著推出了QuantStudioAbsoluteQ一體式數(shù)字PCR系統(tǒng)。系統(tǒng)集成了液滴制備、PCR擴增、熒光信號收集、數(shù)據(jù)分析步驟；最多支持5色熒光通道檢測；檢測全流程1.5小時。賽默飛基因科學(xué)，贊111QuantStudioAbsoluteQ系統(tǒng)采用具有專利的微流體陣列式芯片技術(shù)，單個樣本區(qū)在20480個固定納米級微孔中生成95%以上的有效反應(yīng)液滴，死體積<5%。每張芯片可以靈活的選擇每次檢測4個/8個/12個/16個樣本，液體生成無需使用液滴油，但芯片通路最后需要用油相密封。基本檢測流程是，將PCR反應(yīng)混合物加入陣列式芯片，放入系統(tǒng)中，在陣列式芯片平鋪生成液滴后，利用拍照方式讀取熒光信號，全程無需人員值守。Naica?Crystal（Stilla）Stilla成立于2013年，總部位于法國，2016年推出Nacia數(shù)字PCR產(chǎn)品，2018年由IlluminaVentures領(lǐng)投完成A輪融資。Stilla數(shù)字PCR系統(tǒng)由兩臺設(shè)備組成，產(chǎn)品有Naicacrystal微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)、NaicaHT高通量數(shù)字PCR系統(tǒng)、六通道微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)等。Naica?Crystal微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)采用獨有的cutting-edge微流體創(chuàng)新型2DSapphire芯片，芯片內(nèi)預(yù)置滴液油，僅需將PCR預(yù)混液加入Sapphire或Opal芯片中，后續(xù)的微滴生成、擴增和分析，整個過程在都封閉的芯片中進行。基本的檢測流程是：將PCR反應(yīng)混合物加入芯片，將芯片放入Geode微滴生成擴增儀，生成微液滴樣本于芯片中，在芯片上完成PCR擴增，然后將擴增后的芯片轉(zhuǎn)移至Prism3微滴閱讀分析儀，采取拍照的方式讀取熒光信號。Prism3微滴閱讀分析儀有3色熒光檢測通道。Sapphire芯片上有4個樣本位，每個樣本能生成約30,000個體積25ul的微液滴；Opal高通量芯片上有16個樣本位，每個樣本能生成約20,000個體積7ul的微液滴；Naica?Crystal系統(tǒng)可以使用上述兩種芯片，使用Sapphire芯片可以檢測1~12個樣本，使用Opal高通量芯片可以檢測1~48個樣本。Stilla的Geode微滴生成擴增系統(tǒng)是一個混合系統(tǒng)，結(jié)合了基于腔室的dPCR的二維陣列格式和使用液滴分區(qū)隔離，采用壓力梯度的機制產(chǎn)生液滴；首先，將準(zhǔn)備好的微流控芯片放置在平板熱循環(huán)儀上，并將壓力室的蓋子封緊。然后，隨著分割和PCR程序的啟動，壓力室內(nèi)的壓力逐漸增加到1bar。這個超壓通過壓敏帽傳遞到進氣口的PCR反應(yīng)混合物中，但沒有直接傳遞到用固體魯爾帽密封的出氣口。因此，這種壓力不平衡造成了PCR反應(yīng)混合物從入口端口流向微流控網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)水性PCR反應(yīng)混合物通過液滴注射噴嘴時，它自發(fā)地分解成單分散的液滴，然后被表面張力推進充滿油的微流控室中。隨著越來越多的液滴產(chǎn)生，它們自我排列成一個緊湊的六邊形二維單層。同時，PCR反應(yīng)混合物流入充滿油的腔室，迫使油流經(jīng)廢物通道并進入密封的出口端口，壓縮端口中剩余的空氣。當(dāng)出口端口的壓力與腔內(nèi)施加的超壓平衡時，流動停止。六通道微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)不同的是，微滴閱讀分析儀NaicaPrism有6色熒光檢測通道。QIAcuity（凱杰）凱杰（QIAGEN）2019年收購美國波士頓專注開發(fā)數(shù)字PCR技術(shù)的公司Formulatrix；2020年推出數(shù)字PCR一體機系列產(chǎn)品QIAcuity。IVD智造，贊1QIAcuity系列產(chǎn)品最多支持5色熒光通道檢測，單次上機檢測24~768個樣本，檢測全流程約2小時?；镜臋z測流程是：將PCR反應(yīng)混合物加入納米微孔板后，貼上封板膜，用配套滾輪輥壓，保證面密封，放入系統(tǒng)中，系統(tǒng)自動進行制液滴、擴增、閱讀和分析結(jié)果，全流程無