高效液相色譜儀的使用

關(guān)于高效液相色譜儀的使用第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日一、概述色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年提出。分離出胡蘿卜素、葉綠素和葉黃素。因一戰(zhàn)爆發(fā)并未重視。第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱固定相流動相色譜法第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜的發(fā)展20世紀(jì)70年代高效液相色譜出現(xiàn)1906色譜法發(fā)明20世紀(jì)50年代氣相色譜出現(xiàn)并廣泛使用19世紀(jì)中葉人們開始注意一些簡單的擴(kuò)散現(xiàn)象染料目前HPLC已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜的類型氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高效液相色譜HPLC氣相色譜第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日1.HPLC與經(jīng)典LC

HPLC比起經(jīng)典LC的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢，流動相速度為30ml·h-1，需用20h才能分離出20種氨基酸；而HPLC配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)10ml·min-1，只需lh之內(nèi)即可完成氨基酸的分離。第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日高效：固定相具有分離效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分。高靈敏度：高靈敏度檢測器，可檢測μM級甚至nM級別的待測物。高自動化：操作自動化，可儀器控制流動相比例、流速、波長、出峰時間、進(jìn)樣及自動生成分析報(bào)告等。第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.HPLC與GC（l）氣相色譜法(GC)分析對象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用HPLC進(jìn)行分離和分析。（2)GC中流動相是惰性氣體，它與組分沒有親和力，僅起運(yùn)載作用。而HPLC中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用。（3）GC一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而HPLC可在室溫條件下工作。第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日HPLC應(yīng)用（1）生命化學(xué)：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、酶、維生素等物質(zhì)的分離和測定；（2）化學(xué)與精細(xì)化工：植物色素、高聚物、染料、化工產(chǎn)品、合成化合物等的分離和分析；無機(jī)離子的測定等；（3）農(nóng)業(yè)、食品與醫(yī)藥學(xué)：添加劑（甜味劑、防腐劑、著色劑）、營養(yǎng)成分（蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸等）、藥物體液中代謝物測定；藥代動力學(xué)研究；臨床藥物、農(nóng)藥殘留等；（4）環(huán)境分析與毒理學(xué)：多環(huán)芳烴及農(nóng)藥殘留、DNA加合物分析。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，分離效果好；缺點(diǎn)是儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，需摸索分析方法，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。

第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日二、液液色譜法的分類液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為：正相色譜法反相色譜法第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日正相色譜法固定相極性大于流動相。采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日反相色譜法固定相極性小于流動相。一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。它在液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日三、色譜法的分離原理分離原理樣本組分進(jìn)樣到色譜柱上時，會與固定相發(fā)生作用，包括吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等作用。當(dāng)流動相洗脫色譜柱時，由于各組分與固定相作用的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同，和固定相結(jié)合弱的組分先出來，結(jié)合強(qiáng)的后出來，不同組分會先后從固定相中流出，一個物質(zhì)會形成一個色譜峰。色譜法由于能分離許多物質(zhì)，被稱為分離的巨人。第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時間。←色譜峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日基本術(shù)語色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線。基線(baseline)——在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線。不對稱色譜峰有兩種：前延峰和拖尾峰。前者少見，可能是柱子出問題。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日保留時間(retentiontime，tR)——組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。

當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)N越大，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能越高，所得色譜峰越窄。第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日峰高(peakheight，h)—峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰面積(peakarea，A)—峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值。精密度—日間、日內(nèi)精密度準(zhǔn)確度—加標(biāo)回收率值為（加標(biāo)樣的量－樣品量）×100%

標(biāo)品的量標(biāo)準(zhǔn)曲線第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日定性定量分析及色譜圖標(biāo)準(zhǔn)品-保留時間9.3min標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確定物質(zhì)保留時間定性第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜法定性定量分析1.根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析。2.根據(jù)色譜峰的面積或峰高,可以進(jìn)行定量分析。3.實(shí)驗(yàn)過程（1）確定實(shí)驗(yàn)條件（流動相、流速、檢測波長等）。（2）溶液的配制：流動相、標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。（3）精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。（5）樣品測定。第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜分析用水（1）專門的超純水機(jī),得到Milli-Q水；（2）去離子水重蒸；（3）二次或三次重蒸水；（4）采用類似家用的純水機(jī)；（5）市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水。不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22μm的濾膜，除去有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫箱等。目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京普析分析儀器廠等。四、儀器組成第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日島津公司LC-20第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日Agilent公司

1200LC第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日

為什么要用高壓輸液系統(tǒng)？由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。一元、二元、四元泵。HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。1.輸液泵

第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日輸液泵的主要性能①流速穩(wěn)定：如1ml/min,其RSD應(yīng)＜0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流速量范圍寬：分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高：一般應(yīng)能達(dá)到25MPa或400巴;④密封性能好，耐腐蝕。第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔，盡量帶進(jìn)避免顆粒物質(zhì)，造成泵內(nèi)堵塞；進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下，以免產(chǎn)生結(jié)晶；泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液；輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液；流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.進(jìn)樣器2種方法：（1）一般常用六通進(jìn)樣閥?？捎梦⒘孔⑸淦骰蚨凯h(huán)進(jìn)樣。前者要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。后者進(jìn)樣量應(yīng)大于定量環(huán)體積的3~6倍，這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。（2）自動進(jìn)樣用于大量樣品的常規(guī)分析。

第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日

六通閥進(jìn)樣演示第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日3.色譜柱擔(dān)負(fù)分離作用，是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子。一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱由柱管、柱接頭、篩板（濾片）、堵頭和螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。常規(guī)分析的色譜柱有內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm。

第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱使用注意事項(xiàng)柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動；選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日進(jìn)樣樣品要提純，避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理；在色譜柱前加預(yù)柱或保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用，可更換。每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用清洗柱；第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑如甲醇保存，擰緊柱接頭，防止溶劑揮發(fā)干燥。新柱不用是可放時間長些。柱壓升高的原因有樣品和流動相有雜質(zhì)或顆粒、緩沖液鹽結(jié)晶使柱子堵塞、體系不平衡等。通常色譜柱壽命在正確使用時可達(dá)2年以上。第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑和樣品過濾對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用。對色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。對儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日4.檢測器檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。檢測器的類型有紫外可見光、熒光、電化學(xué)、電導(dǎo)、放射性檢測器等。第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日性能指標(biāo)

（1）噪音和漂移都會影響測定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。（2）靈敏度：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。（3）檢測限（LOD）：試樣中被測物能被檢測到的最低量，以信噪比接近為3:1時的相應(yīng)濃度作為檢測限。以信噪比接近為10:1時的相應(yīng)濃度作為定量限（LOQ）第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日（4）線性范圍：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍。檢測器所產(chǎn)生的信號與被測樣品的量呈一定的函數(shù)關(guān)系作為依據(jù)。線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些。

第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日5.色譜工作站色譜工作站主要有電腦、信號記錄系統(tǒng)和分析軟件。不同的色譜工作站在處理數(shù)據(jù)時情況不同，但目前大多是記錄儀記錄檢測信號，使用積分儀計(jì)算峰高、峰面積和保留時間等參數(shù)。好的工作站除能采集、處理和分析數(shù)據(jù)外，還能控制儀器操作，對色譜系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日6.柱溫箱色譜柱和檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間。溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。

溫度對保留時間有影響。要根據(jù)色譜柱說明書上要求的最適宜溫度設(shè)置柱溫箱的溫度。第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日7.超聲脫氣流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起猝滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。一般流動相溶液需超聲20~30min。這種離線脫氣不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中，在1~4小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日8.燈的保養(yǎng)熒光分析用的是氙燈，5000元左右，壽命在800小時左右。因此在色譜柱平衡得差不多、要開始分析時，再打開檢測器熒光燈；在分析完成后，馬上關(guān)閉氙燈。第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日五、儀器分析過程與操作1.流動相的貯存：

一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染，造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.流動相比例調(diào)整：

按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時間為6~15分鐘為宜。所以建議第一次檢驗(yàn)時請少配流動相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請注意充分平衡柱。流動相組成、pH、比例摸好后，即按此條件測定樣品。流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日3．樣品配制：玻璃容器必須洗凈，酸泡處理后使用，盡量少用或不用塑料容器。HPLC應(yīng)用中要求用超純水或純凈水或三蒸水配置樣品。樣品配制應(yīng)嚴(yán)格按照方法要求的步驟進(jìn)行。樣品配制同時還需配制標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定和目的峰的確定。第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日4.記錄時間：第一次測定時，應(yīng)先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如50min-60min），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日5.進(jìn)樣量：應(yīng)注意進(jìn)樣量要準(zhǔn)確、一致。20微升或10微升可由預(yù)實(shí)驗(yàn)或標(biāo)準(zhǔn)方法確定。

6.確定目的峰的保留時間。7.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8.測定精密度和準(zhǔn)確度。9.樣品測定。10.分析數(shù)據(jù)。第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日Agilent1200LC操作步驟開機(jī)及分析（1）把流動相放入溶劑瓶中，用超聲波脫氣20min，放置20-30min后使用。（2）打開1200LC脫氣裝置、泵、檢測器及工作站電源。（3）打開電腦,進(jìn)入在線分析系統(tǒng)。（4）打開控制異丙醇流速的閥，用注射器抽氣，直到液體流出，控制流速。第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日（5）排氣：打開“Purge”閥(往左扭松)，點(diǎn)擊“泵”圖標(biāo)，點(diǎn)擊“設(shè)置泵”選項(xiàng)，設(shè)置流速1m