第二章基因工程制藥演示文稿

第二章基因工程制藥演示文稿當(dāng)前1頁，總共45頁。優(yōu)選第二章基因工程制藥當(dāng)前2頁，總共45頁。1、基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。2、宿主細(xì)胞的分類：①原核細(xì)胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；②真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。知識回顧當(dāng)前3頁，總共45頁。3、提高外源基因在E.coli表達(dá)效率：（1）外源基因的劑量（2）外源基因的表達(dá)效率（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件知識回顧當(dāng)前4頁，總共45頁。4、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式:⑴以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因⑵以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因⑶分泌型表達(dá)藥物基因

知識回顧當(dāng)前5頁，總共45頁。5、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。當(dāng)前6頁，總共45頁。6、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法選擇合適的宿主菌選擇合適的載體選擇壓力分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件固定化當(dāng)前7頁，總共45頁。第六節(jié)基因工程藥物的分離純化

基因工程藥物或生物技術(shù)產(chǎn)品特點(diǎn):(1)目的產(chǎn)物在初始原料中的含量較低;(2)含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜,除了目的產(chǎn)物外,還有大量的細(xì)胞、代謝、殘留培養(yǎng)基、無機(jī)鹽等，特別是產(chǎn)物類似物對目的產(chǎn)物的分離純化影響很大；當(dāng)前8頁，總共45頁。(3)目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易是其失活、變性；

種類繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)；

應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源。當(dāng)前9頁，總共45頁。一、建立分離純化工藝的根據(jù)1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過程中的各種因素均對分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。當(dāng)前10頁，總共45頁。一、建立分離純化工藝的根據(jù)（1）菌種類型及其代謝特性：（2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量；（3）生產(chǎn)工藝和條件：（4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性：當(dāng)前11頁，總共45頁。一、建立分離純化工藝的根據(jù)2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)物料中雜質(zhì)的含量、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性、吸附性能等。當(dāng)前12頁，總共45頁。一、建立分離純化工藝的根據(jù)3、目的產(chǎn)物特性產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物學(xué)活性、親和性、配基種類、表面活性等。當(dāng)前13頁，總共45頁。一、建立分離純化工藝的根據(jù)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途對產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。包括允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì)的種類和最大允許量，以及雜質(zhì)對使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。當(dāng)前14頁，總共45頁。二、分離純化的基本過程

由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，所以對產(chǎn)品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產(chǎn)品?；蚬こ趟幬锏姆蛛x純化一般不應(yīng)超過4-5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。當(dāng)前15頁，總共45頁。

基因工程藥物分離純化的一般流程發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品當(dāng)前16頁，總共45頁。三、分離純化的技術(shù)1）技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；

2）選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的地將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高純化倍數(shù)；

3）收率要高；

4）兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟；

5）整個(gè)分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。當(dāng)前17頁，總共45頁。3-1、細(xì)胞破碎與固液分離

（1）細(xì)胞收集：離心和膜過濾（2）細(xì)胞破碎：機(jī)械法高壓勻漿、超聲波、高速珠磨、高壓擠壓等。非機(jī)械法酶溶、化學(xué)滲透、熱處理、滲透壓沖擊法。（3）固液分離：分離細(xì)胞碎片是比較困難。一般用離心和膜過濾。當(dāng)前18頁，總共45頁。3-2、目的產(chǎn)物的分離純化

分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。色譜技術(shù)分為：

IonexchangechromatographyHydrophobicinteractionchromatographyAffinitychromatographyGelFiltrationchromatography當(dāng)前19頁，總共45頁。

表1產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用產(chǎn)物特性作用

等電點(diǎn)決定離子交換的種類及條件

相對分子質(zhì)量選擇不同孔徑及分級分離范圍的介質(zhì)

疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度

特殊反應(yīng)性產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制

聚合性是否采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用的溫度及流程時(shí)間微不均一性影響產(chǎn)物的回收當(dāng)前20頁，總共45頁。

表2基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法

方法目的

離心/過濾去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、顆粒性雜質(zhì)陰離子交換層析去除雜志蛋白、脂質(zhì)、DNA、病毒

40nm微孔濾膜過濾進(jìn)一步去除病毒陽離子交換層析去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等超濾去除沉淀物及病毒疏水層析去除殘余的雜蛋白凝膠過濾與多聚體分離

0.22μm微孔濾膜過濾除菌當(dāng)前21頁，總共45頁。1）具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；

2）盡可能減少組成工藝的步驟；

3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝和設(shè)備相適應(yīng)。

4）在工藝過程中盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產(chǎn)品質(zhì)量；

3-3、分離純化工藝應(yīng)遵循的原則當(dāng)前22頁，總共45頁。5）分離純化工藝所用的時(shí)間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物；

6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對設(shè)備條件要求低，能耗低；

7）具有較高的安全性。3-3、分離純化工藝應(yīng)遵循的原則當(dāng)前23頁，總共45頁。第七節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制一、原材料的質(zhì)量控制

確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。當(dāng)前24頁，總共45頁。一、原材料的質(zhì)量控制（1）明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證；（2）提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分（如啟動(dòng)子、復(fù)制子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物；當(dāng)前25頁，總共45頁。（3）提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；（4）闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；一、原材料的質(zhì)量控制當(dāng)前26頁，總共45頁。（5）提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。一、原材料的質(zhì)量控制當(dāng)前27頁，總共45頁。在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制當(dāng)前28頁，總共45頁。（1）生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫；（2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制當(dāng)前29頁，總共45頁。（3）對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制當(dāng)前30頁，總共45頁。（5）培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；以宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期評價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制當(dāng)前31頁，總共45頁。（6）培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)檢測宿主宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制當(dāng)前32頁，總共45頁。三、純化工藝中的質(zhì)量控制1、產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。

2、在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核算、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。當(dāng)前33頁，總共45頁。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

電泳方法：SDS,等電聚焦，免疫電泳免疫學(xué)方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting

受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（ReceptorBinding）各種高效液相分析法（HPLC）肽圖分析法

EdmanN末端序列分析法圓二色譜（CD）

NMR1、產(chǎn)品的鑒別表3重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒別方法當(dāng)前34頁，總共45頁。（1）肽圖分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15個(gè)氨基酸（4）重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子質(zhì)量測定（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析1、產(chǎn)品的鑒別當(dāng)前35頁，總共45頁。2、純度分析（1）目的蛋白質(zhì)含量測定（2）雜質(zhì)：分蛋白類雜質(zhì)和非蛋白類雜質(zhì)。3、生物化學(xué)測定4、穩(wěn)定性考察5、產(chǎn)品一致性的保證1、產(chǎn)品的鑒別當(dāng)前36頁，總共45頁。

雜質(zhì)和污染物檢測方法

內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱源法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SD、CE

其他蛋白雜質(zhì)（如培養(yǎng)基）SDS、HPLC、CE、免疫分析殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE

甲?；琢虬彼犭淖V、HPLC、IEF、CE表4基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法當(dāng)前37頁，總共45頁。

甲硫氨酸氧化肽譜、氨基酸分析、HPLC、質(zhì)譜、Edman分析產(chǎn)物變性或聚合脫氨基SDS、凝膠排阻色譜、

IEF、HPLC、

Edman分析、CE

親和配基脫落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、CE、

Edman分析、質(zhì)譜微生物（細(xì)菌、酵母、真菌）微生物學(xué)檢查支原體