外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控

外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控第1頁/共45頁第七章

外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控

第一節(jié)

真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控第二節(jié)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因第三節(jié)

真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類第2頁/共45頁第一節(jié)

真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控

一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)及優(yōu)勢二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件第3頁/共45頁第二節(jié)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因

一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記（定義）二、二氫葉酸還原酶基因選擇標(biāo)記三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記四、氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇標(biāo)記五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因第4頁/共45頁第三節(jié)

真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類

一、載體的類型二、幾種常用的真核表達(dá)載體第5頁/共45頁一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)及優(yōu)勢

1.細(xì)胞的全能性2.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行3.有相當(dāng)大的非編碼區(qū)（調(diào)控序列）4.有三種不同RNA聚合酶參與轉(zhuǎn)錄5.初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能進(jìn)行剪接加工修飾6.不存在操縱子結(jié)構(gòu)7.基因多拷貝，功能基因分散在不同區(qū)域，分別轉(zhuǎn)錄第6頁/共45頁二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件

（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

（三）翻譯水平的調(diào)控

第7頁/共45頁胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補(bǔ)救代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。第8頁/共45頁一、載體的類型1.質(zhì)粒型載體2.病毒載體3.整合型表達(dá)載體4.游離型表達(dá)載體5.瞬時表達(dá)載體6.穩(wěn)定性表達(dá)載體7.非復(fù)制性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體第9頁/共45頁二、幾種常用的真核表達(dá)載體㈠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體㈡痘類病毒載體㈢HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質(zhì)粒型載體3.裂解型病毒載體

第10頁/共45頁（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

基因調(diào)控的順式作用元件啟動子增強(qiáng)子RNA剪接信號負(fù)調(diào)控元件終止子和polyA信號基因調(diào)控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用規(guī)律第11頁/共45頁（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控mRNA前體加工：轉(zhuǎn)錄的mRNA前體經(jīng)5’加帽，3’酶切加尾去除內(nèi)含子后，產(chǎn)生成熟mRNA，通過核孔進(jìn)入胞質(zhì)中。RNA編輯（RNAediting）第12頁/共45頁（三）翻譯水平的調(diào)控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應(yīng)由模板來源的遺傳信息，進(jìn)而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質(zhì)，這是生物適應(yīng)性的保護(hù)措施。第13頁/共45頁順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄按效應(yīng)和功能可分為啟動子、增強(qiáng)子、RNA間接信號、負(fù)調(diào)控元件、終止子等調(diào)控元件。第14頁/共45頁反式作用因子主要作用規(guī)律同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識別同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多數(shù)是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先相互作用后，再與DNA結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的自身生物合成有相當(dāng)大的可變性、可塑性。反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結(jié)構(gòu)域，有兩種類型：通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域?yàn)樽R別特異DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如：鋅指結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)域又稱轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，如：酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域。不同結(jié)構(gòu)域各自的特征第15頁/共45頁不同結(jié)構(gòu)域各自的特征通用轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)亮氨酸拉鏈螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域第16頁/共45頁RNA編輯（RNAediting）RNA編輯是在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后，能夠改變RNA分子編碼特性，是與剪切形式不同的一種修飾形式，如可使mRNA某位點(diǎn)密碼子CAA轉(zhuǎn)變?yōu)閁AA，使C變U，編輯的結(jié)果形成了UAA終止密碼子，在編碼酶的作用下，除使C變U，還可在RNA上添加多個U或呈單個C的添加，使前體mRNA變成成熟mRNA時，通過插入或替換方式，可改變和擴(kuò)大原遺傳信息，編碼多種蛋白,是生物的適應(yīng)性保護(hù)。第17頁/共45頁翻譯起始序列

在ATG起始密碼子周圍要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻譯起始，若發(fā)生突變，其翻譯水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比較多的二級結(jié)構(gòu)序列，也會影響翻譯，建議外源基因的5’端AUG上游序列不宜過長。第18頁/共45頁eIF-2的磷酸化反應(yīng)eIF-2為轉(zhuǎn)譯起始因子-2是蛋白質(zhì)合成起始階段13種起始因子中最為關(guān)注的因子。若轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA的兩條鏈一旦都發(fā)生轉(zhuǎn)錄，就會形成雙鏈互補(bǔ)mRNA，而激活胞內(nèi)的雙鏈RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）該激酶可使eIF-2的α-亞基磷酸化，轉(zhuǎn)譯受抑，為防止該激酶活化，常在載體上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止雙鏈RNA對DAI激酶的激活作用，使轉(zhuǎn)譯得以正常進(jìn)行。第19頁/共45頁一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記外源基因+載體(TK+)的重組體導(dǎo)入TK-細(xì)胞中，在HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基中篩選，TK-細(xì)胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+細(xì)胞可存活，以此進(jìn)行篩選。（HSV-1的TK基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞加GCV后被殺死，如小鼠LMTK-細(xì)胞。）注：TK++BrUdR因摻入后對紫外線敏感而死亡，

TK-+BrUdR因不摻入，對紫外線不敏感而存活。第20頁/共45頁二、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）選擇標(biāo)記DHFR是合成dATP和dGTP的關(guān)鍵酶。常用DHFR—的CHO細(xì)胞因不能合成四氫葉酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長。在不含該培養(yǎng)基中導(dǎo)入該標(biāo)記基因重組子，則可篩選出陽性克隆，也可將DHFR基因置在強(qiáng)啟動子下高表達(dá)或通過DHFR基因突變以提高抵抗高濃度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）的能力，從而篩選陽性克隆。第21頁/共45頁三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記新霉素類似物G418抗生素，可影響80s核糖體RNA功能，對細(xì)胞有毒性。新霉素抗性基因neo的載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，可在含G418培養(yǎng)基中篩選重組體轉(zhuǎn)化的陽性克隆細(xì)胞。陽性克隆存活，陰性者死亡。第22頁/共45頁五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因哺乳動物細(xì)胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細(xì)胞可通過IMP生成GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。將含XGPRT基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP中間體補(bǔ)救合成GMP，使DNA合成正常進(jìn)行，加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉(zhuǎn)化的陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細(xì)胞。第23頁/共45頁1.質(zhì)粒型載體

質(zhì)粒型載體（穿梭載體）：實(shí)際上是病毒質(zhì)粒型載體，共有兩套復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，在原核中復(fù)制，真核中表達(dá)。第24頁/共45頁2.病毒載體

病毒載體種類多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V?？稍诿舾屑?xì)胞中復(fù)制，表達(dá)外源基因，有的還可通過整合后表達(dá)。第25頁/共45頁3.整合型表達(dá)載體

RV、SV40可攜帶外源基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)。第26頁/共45頁4.游離型表達(dá)載體

該病毒載體是以完整的或缺陷病毒形式攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后不發(fā)生整合，可在胞漿中游離復(fù)制，表達(dá)外源基因，如痘苗V、Adv。第27頁/共45頁5.瞬時表達(dá)載體瞬時表達(dá)載體（轉(zhuǎn)染后70-90h左右）：含病毒復(fù)制子的病毒載體，可攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，不整合到染色體上，只在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行暫時性表達(dá)，不能隨細(xì)胞傳代，隨后逐漸降低或消失。常用SV40復(fù)制子載體，在COS細(xì)胞中表達(dá)，由于載體復(fù)制，若超過104個/細(xì)胞，細(xì)胞不能承受而死亡。第28頁/共45頁6.穩(wěn)定性表達(dá)載體將外源基因與具標(biāo)記基因（DHFR）病毒載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞（CHO），可將基因整合到細(xì)胞染色體上，可隨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)和傳代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此篩選陽性克隆。）第29頁/共45頁7.非復(fù)制性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體

HSV-1病毒去除α極早期基因，失去復(fù)制能力，但攜帶外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后高效表達(dá)，毒性小，轉(zhuǎn)染和表達(dá)能力強(qiáng)。第30頁/共45頁8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體

HSV-1病毒去除了β早期基因，而不能產(chǎn)生DNA合成所需的酶，該病毒在靜止細(xì)胞中不能復(fù)制和裂解細(xì)胞，但在高度分裂活躍的細(xì)胞中（如腫瘤）可復(fù)制并裂解感染的細(xì)胞，因分裂活躍細(xì)胞可提供病毒復(fù)制所需的DNA合成酶，復(fù)制時只殺死腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞無損害。第31頁/共45頁㈠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是RNA單鏈，pol基因產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶，使單鏈生成雙鏈。有5’、3’的U3RU5的長末端重復(fù)序列，有TATA強(qiáng)啟動子和加尾功能，經(jīng)體外包裝，可整合表達(dá)。穿梭質(zhì)粒載體組裝基因后，可由輔助病毒協(xié)助或經(jīng)體外細(xì)胞包裝，形成具感染性假病毒顆粒，再感染宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。第32頁/共45頁㈡痘類病毒載體

已用于構(gòu)建多價活疫苗載體（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-Ⅱ、EBV等。該載體的雙鏈DNA的大病毒載體，組裝量大，安全，可在細(xì)胞獨(dú)立復(fù)制，表達(dá)。第33頁/共45頁1.重組病毒型載體

在HSV-1非必需區(qū)插入外源基因的重組體DNA與野毒株共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可發(fā)生同源重組，通過LacZ篩選，轉(zhuǎn)染效率高，無需輔助病毒，但有毒性作用。第34頁/共45頁啟動子大多位于基因5’端上游區(qū)，是一種與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5’端DNA序列，在-30bp區(qū)有TATAbox，可引導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始，在-70~-80bp區(qū)還有GCbox，可協(xié)同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率。常用的啟動子有RSV啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子。第35頁/共45頁增強(qiáng)子增強(qiáng)子是一類可使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的順式作用元件，本身無啟動子活性，可獨(dú)立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟動作用，而且無方向性。它有特征性序列，常由812bp組成，以單拷貝或多拷貝的形式存在。增強(qiáng)子可使轉(zhuǎn)錄效率增強(qiáng)10-100倍，通常來源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增強(qiáng)子的作用使表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性時，最好改用誘導(dǎo)型啟動子來表達(dá)外源基因，如熱休克啟動子、金屬硫蛋白啟動子。第36頁/共45頁RNA剪接信號雖然cDNA來源的基因轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞后，其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響，但在該細(xì)胞中表達(dá)最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號，以提供對cDNA基因表達(dá)的需要，常用SV40的小t抗原的內(nèi)含子序列來作為cDNA中的內(nèi)含子剪接序列。第37頁/共45頁負(fù)調(diào)控元件沉默子和衰減子為轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件，它們與反式作用因子相互作用而起作用，不受距離、方向、基因來源的限制。第38頁/共45頁終止子和polyA信號真核基因轉(zhuǎn)錄的確切終止信號和終止機(jī)制目前尚不清楚，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在模板DNA分子3’端有一終止序列，稱終止子，產(chǎn)生具有polyA尾的轉(zhuǎn)錄序列，在DNA區(qū)域內(nèi)G/T簇。如SV40中的終止子序列為AGGTTTTTT的DNA序列，并有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。polyA可使mRNA穩(wěn)定其多聚腺苷酸化需要兩種序列：①位于polyA位點(diǎn)下游的GU或U豐富區(qū)，②位于polyA上游11-30bp處的6bp高度保守序列（5’-AAUAAA）與轉(zhuǎn)錄后的RNA切割和加尾有關(guān)。第39頁/共45頁反式作用因子的概念反式作用因子是一組能直接或間接地與DNA的順式作用元件特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白，即DNA結(jié)合蛋白（DBP），DBP又稱轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）分通用轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類。基因表達(dá)的組織特異性及細(xì)胞周期特異性受上述元件和因子的相互作用所決定，通用轉(zhuǎn)錄因子中識別TATAbox的為TFⅡD，可與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合使轉(zhuǎn)錄起始，識別GCbox的DBP為SP1，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。第40頁/共45頁鋅指結(jié)構(gòu)鋅指（zinefinger）結(jié)構(gòu)：由兩個半胱氨酸（Cys）和兩個組氨酸（His）殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定