植物組織中超氧化物歧化酶活性測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)五植物組織中超氧化物歧化酶活性測(cè)定指導(dǎo)老師：王小燕一、實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶（superoxide

dismutase,SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，它催化下列反應(yīng)：

2O

+2H

→H

O

+O

本反應(yīng)產(chǎn)物H

O

可由過(guò)氧化氫酶進(jìn)一步分解或被過(guò)氧化物酶利用。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料

水稻或小麥葉片。

（二）儀器設(shè)備

高速臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，微量進(jìn)樣器，熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000lx），試管或指形管數(shù)支。

（三）試劑

（1）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。

（3）750μmol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。

（4）100μmol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721g

EDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml。

（5）20

μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、酶液提取

取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.5－2ml于1000r/min下離心20min，上清液即為SOD粗提液。

2、顯色反應(yīng)

取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下表加入各種溶液：

各溶液顯色反應(yīng)用量

混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其他各管于4000lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3、SOD活性測(cè)定與計(jì)算

至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管作空白，分別測(cè)定其他各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。

SOD總活性＝

式中：SOD總活性以鮮重酶單位每克表示；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；A

為照光對(duì)照管的吸光度；A

為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積ml，V

為測(cè)定時(shí)樣品用量ml；W為樣鮮重g；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。Theend.內(nèi)容總結(jié)實(shí)驗(yàn)五植物組織中超氧化物歧化酶活性測(cè)定。二、材料、儀器設(shè)備及試劑。（三）試劑

（1）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。（5）20

μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存。1、酶液提取

取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml?；靹蚝髮?支對(duì)照管置暗處，其他各管于4000lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3、SOD活性測(cè)定與