要求的艾滋病檢測實驗室中進(jìn)行

第十單元免疫缺陷性疾病的免疫學(xué)檢測

試驗一HIV抗體初篩試驗獲得性免疫缺陷綜合征是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的以CD4+T細(xì)胞削減為主要特征，同時伴反復(fù)機(jī)會感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的一組綜合征。HIV感染的免疫學(xué)檢驗方法主要針對病毒抗原和抗病毒抗體的檢測以及免疫細(xì)胞數(shù)量和功能的分析。HIV抗體初篩試驗主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗、快速檢測試驗（明膠顆粒凝集試驗、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗）等。ELISA是最常用的HIV抗體初篩試驗方法。本試驗接受雙抗原夾心ELISA法檢測人血清中HIV抗體。檢測方法在符合Ⅱ級生物平安試驗室（BSL-2）要求的艾滋病檢測試驗室中進(jìn)行。試驗條件將HIV抗原包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標(biāo)記的HIV抗原，形成抗原－抗體－酶標(biāo)抗原復(fù)合物，洗滌，加底物顯色。通過酶標(biāo)儀檢測吸光度A450nm值，依據(jù)A450nm值推斷HIV抗體的存在與否。試驗原理1.HIV抗原酶標(biāo)板。2.洗滌液PBS-Tween20。3.辣根過氧化物酶標(biāo)記的HIV抗原。4.辣根過氧化物酶底物溶液。5.底物稀釋液PBS-1%BSA。6.終止液2mol/lH2SO4溶液。7.比照血清臨床標(biāo)本篩選獲得的陽性血清和陰性血清。8.酶標(biāo)儀、洗板機(jī)。試劑與器材操作步驟編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板設(shè)陰性比照2孔、陽性比照3孔，空白比照2孔加樣：分別在相應(yīng)孔加入待檢標(biāo)本、陰性、陽性比照100μl，用封板膜封板后置37℃溫育60min。洗滌：用洗板機(jī)清洗，在干凈濾紙上拍干。加酶：每孔加酶結(jié)合物100μl（空白比照孔除外），充分混勻，置37℃溫育30min。洗滌：用洗板機(jī)清洗，在干凈濾紙上拍干。顯色：每孔加入底物緩沖液50μl，TMB50μl，振蕩混勻，37℃避光顯色10min。測定：每孔加終止液50μl，振蕩混勻。在450nm波長下，酶標(biāo)儀測定各孔A450nm值。結(jié)果推斷計算臨界值：臨界值=陽性比照值×10%。正常狀況下，陽性比照孔的A450nm值≥0.80，樣品A450nm值≥臨界值者為HIV抗體陽性。正常狀況下，陰性比照孔的A450nm值≤0.08，樣品A450nm值＜臨界值者為HIV抗體陰性。留意事項試驗中設(shè)立陽性與陰性比照。底物顯色時間不宜過長。留意生物平安。對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品，應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢試驗。如復(fù)檢均呈陰性，則報告HIV抗體陰性（-）；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，應(yīng)送HIV確證明驗室進(jìn)行確證試驗。臨床意義作為HIV感染的篩查試驗。HIV有兩個血清型：HIV-1和HIV-2，后者少見。此試驗陽性者應(yīng)進(jìn)一步作確證試驗。思索題ELISA是檢測HIV抗體的常用方法，但并不是唯一的方法?；瘜W(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗、免疫膠體金以及免疫層析試驗等均可用于HIV抗體的檢測，試比較各種方法之間的優(yōu)缺點。第三軍醫(yī)高校吳超試驗二HIV確認(rèn)試驗HIV抗體初篩試驗陽性者，須作確證試驗。確證明驗必需在特地的艾滋病確證明驗室中進(jìn)行，并最終確定患者是否感染HIV。確證試驗方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗、免疫熒光試驗等。免疫印跡試驗(WesternBlot，WB)是用以檢測HIV抗體的首選確證試驗方法，其檢測結(jié)果常常被作為鑒別其他檢驗方法優(yōu)劣的“金標(biāo)準(zhǔn)”。以硝酸纖維素膜為載體的抗原條，組合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2gp36重組蛋白抗原。當(dāng)抗原條與被檢血清及比照血清接觸時，如血清標(biāo)本有HIV-1/HIV-2特異性抗體，將會與抗原條上的HIV-1/HIV-2gp36抗原結(jié)合。結(jié)合的抗體再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物顯色，視察結(jié)果推斷。試驗原理1.HIV1/2抗原硝酸纖維膜條

20條2.印跡緩沖液（10×）

12ml3.漂洗緩沖液（10×）

60ml4.底物BCIP/NBT溶液

50ml5.結(jié)合物

70μl6.HIV1/2陰性比照血清

70μl7.HIV1弱陽性比照血清

70μl8.HIV1強(qiáng)陽性比照血清

70μl9.反應(yīng)槽、搖床、移液管、吸引器試劑與器材操作步驟取出反應(yīng)槽，每一槽內(nèi)加2ml漂洗緩沖液。用鑷子當(dāng)心地夾住抗原條編號端放入漂洗緩沖液中，編號面朝上，每槽1條，讓溶液完全覆蓋。將反應(yīng)槽放置搖床，搖動5～10分鐘后吸棄漂洗液。每槽加入印跡緩沖液2ml，然后分別加入20μl待檢血清或血漿，并用本試劑盒中的比照血清作平行比照。在室溫下將反應(yīng)槽在搖床上搖動60分鐘。旋搖完畢后，吸棄印跡緩沖液。每槽加入2ml漂洗緩沖液，旋搖5分鐘后，吸棄漂洗緩沖液，共漂洗3次，每次5分鐘。在每槽中加入2ml結(jié)合物稀釋液，旋搖45分鐘。從槽中吸棄結(jié)合物稀釋液，重復(fù)步驟6。每槽中加入底物2ml，旋搖15分鐘。吸去底物液，每槽中加入2ml蒸餾水，旋搖5分鐘后，終止反應(yīng)。將抗原條放于二張濾紙間吸干水分后視察結(jié)果。結(jié)果推斷1.比照血清檢測結(jié)果判定要求①HIV-1強(qiáng)陽性比照血清：必需出現(xiàn)gp160/gp120和gp41、p24帶型，以及p66、p55/p51、p34、p17帶型判定為陽性，HIV-2gp36應(yīng)為陰性。②HIV-1弱陽性比照血清：在gp160、gp120和gp41、p24帶型中至少出現(xiàn)二條，判定為陽性。其他位置其可能出現(xiàn)弱帶，但對分析并非必需。HIV-2gp36應(yīng)為陰性。③HIV-2陽性比照血清：必需出現(xiàn)gp36重組蛋白帶型。④陰性比照血清：應(yīng)無上述的特異性帶型出現(xiàn)。2.被檢血清/血漿的判定標(biāo)準(zhǔn)有下列狀況之一者判定為HIV-1抗體陽性。①至少一條env帶和一條pol帶；②至少一條env帶和一條gag帶；③至少一條env帶、一條gag帶和一條pol帶；④至少二條env帶；有HIV-2gp36重組蛋白帶型出現(xiàn)者判定為HIV-2抗體陽性，需用HIV－2確認(rèn)試劑進(jìn)一步檢測。無HIV抗體特異性帶型出現(xiàn)者判定為HIV抗體陰性。出現(xiàn)HIV特異性抗體帶型，但帶型不足以確認(rèn)陽性者，判定為HIV抗體可疑。留意事項試驗中必需同時設(shè)定HIV-1強(qiáng)陽性、HIV-1弱陽性和HIV-1+2陰性血清比照。假如抗原條和血清樣品作用時間過長，陰性樣品也可能出現(xiàn)弱帶。凡溶血、脂血或混濁樣品均為不宜檢測標(biāo)本。試驗中操作應(yīng)留意生物平安。底物顯色時間，一般限制在30分鐘內(nèi)。時間太長，本底變深；假如強(qiáng)陽性血清色帶增深時可提前終止反應(yīng)；若弱陽性比照血清色帶較淺，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間。臨床意義用于在初篩試劑推斷為HIV陽性(如ELISA法)基礎(chǔ)上的血清或血漿樣本，進(jìn)行確證是否為HIV-1陽性及診斷是否感染了HIV-2。思索題HIV血清抗體檢測的初篩試驗和確認(rèn)試驗在檢測HIV感染的臨床意義及試驗原理上的差異？免疫印記試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗及免疫熒光試驗（IFA）等均可用作HIV的確認(rèn)試驗，試分析免疫印記試驗應(yīng)用如此廣泛的緣由?第三軍醫(yī)高校吳超試驗三T細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞儀檢測HIV感染可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)中CD4+T細(xì)胞數(shù)量削減以及CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例失調(diào)，因此，CD4+T細(xì)胞計數(shù)可用于評價HIV感染者免疫狀況，協(xié)助臨床進(jìn)行疾病分期。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量還可評估HIV感染者機(jī)會性感染的風(fēng)險，協(xié)助推斷是否進(jìn)行預(yù)防性治療。背景學(xué)問CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定法，另一類是非流式細(xì)胞儀測定法。其中，流式細(xì)胞儀檢測是目前應(yīng)用較為普遍的一種方法，包括多平臺法和單平臺法。單平臺法僅須要流式細(xì)胞儀進(jìn)行群體細(xì)胞的相對計數(shù)。本試驗主要介紹單平臺法對T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測。流式細(xì)胞儀可檢測單細(xì)胞或微粒的信號，將待測細(xì)胞或微粒進(jìn)行熒光染色后制成懸液標(biāo)本，在確定氣體壓力下將待測樣品壓入流淌室，待測細(xì)胞在鞘液的包袱下單行排列，依次通過流式細(xì)胞儀的檢測區(qū)域。單平臺方法即應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參確定計數(shù)微球，加上流式細(xì)胞儀淋巴細(xì)胞亞群獲得和分析軟件，一步即可獲得T細(xì)胞亞群的相對數(shù)（百分比）和確定數(shù)。通過運(yùn)用已知數(shù)量的參考微球為內(nèi)參，可通過獲得的目標(biāo)細(xì)胞與參考微球的比例、參考微球數(shù)量和樣品體積，得到每微升的淋巴細(xì)胞數(shù)量。試驗原理TruCOUNT確定計數(shù)管。TriTEST三色試劑CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP或MultiTEST四色試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC。FACSLysingSolution（10X）蒸餾水（0.45μm過濾）配制成1X濃度的溶血素；PBS鞘液0.45μm過濾；BDCaliBRITEBeads及BDTruCOUNTcontrols。流式細(xì)胞儀。試劑與器材操作步驟1.標(biāo)本制備：采集外周靜脈血2-3ml,EDTA-K3抗凝。標(biāo)本與試劑用前輕輕搖勻；2.精確加入20μl熒光試劑和50μl全血，充分混勻；3.充分混勻，室溫（20～25℃）避光反應(yīng)15min；4.加入450μlFACS溶血液(1X)，充分混勻；5.充分混勻，室溫（20～25℃）避光放置15min；6.24h內(nèi)流式檢測。單平臺一步法由計算機(jī)軟件干脆出結(jié)果并打印出報告單，報告單的內(nèi)容包括如下：項目單位參考正常值范圍CD3+/CD45+%56%～85%CD3+絕對數(shù)個/μl1027～2086CD3++CD8+/CD45+%15%～34%CD3++CD8+絕對數(shù)個/μl323～836CD3++CD4+/CD45+%30%～54%CD3++CD4+絕對數(shù)個/μl706～1125CD4+/CD8+比值1～2結(jié)果推斷留意事項用于流式細(xì)胞儀免疫表型檢測的抗凝劑K2EDTA、K3EDTA、酸性枸櫞酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝一般要求48h內(nèi)染色，染色后6h內(nèi)分析。如采血后24h內(nèi)染色，則可在染色后24h內(nèi)分析。在室溫（18～25℃）保存和運(yùn)輸樣品，避開極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。溶血、凝血或結(jié)冰的樣品應(yīng)視為不合格樣品，超過檢測允許時間的樣品不行檢測。應(yīng)報告全部相關(guān)數(shù)據(jù)的正常值范圍，且每個試驗室都應(yīng)測定參考數(shù)值。臨床意義①用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴細(xì)胞＜200/μl或CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比＜14%的HIV感染者可歸入艾滋病。②推斷HIV感染的臨床合并癥：如CD4+T淋巴細(xì)胞＜200/μl時，易發(fā)生卡氏肺囊蟲肺炎；而巨細(xì)胞病毒感染和鳥分支桿菌感染常發(fā)生于CD4+T淋巴細(xì)胞＜50/μl的病人，極少見于CD4+T淋巴細(xì)胞＞100/μl的病人。思索題T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測技術(shù)包括多平臺法和單平臺法，試述兩種方法的差異？第三軍醫(yī)高校吳超臨床見習(xí)：HIV抗體初篩試驗了解HIV抗體初篩試驗的試驗室要求和檢測流程與質(zhì)量限制，熟悉用于HIV抗體初篩試驗的樣品種類與采集要求，駕馭HIV抗體初篩試驗中ELISA檢測方法原理與結(jié)果分析。見習(xí)要點接受雙抗原夾心ELISA法檢測血清中HIV（1+2）抗體。HIV抗原包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標(biāo)記的HIV抗原，形成抗原－抗體－酶標(biāo)抗原復(fù)合物，洗滌，加底物顯色。通過酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD值），依據(jù)OD值推斷HIV抗體的存在與否?；驹順悠返牟杉c要求HIV抗體初篩試驗可接受血清、血漿樣品。1．采樣前準(zhǔn)備依據(jù)檢測項目的具體要求，確定采集樣品的種類、處理、保存及運(yùn)輸?shù)臅r限和方法，依據(jù)臨床采血技術(shù)規(guī)范的要求操作，遵守生物平安要求。檢查所需物品是否已備齊，是否在有效期內(nèi)，有無破損，是否足量，特殊應(yīng)檢查受檢者信息與樣品容器表面的標(biāo)記是否一樣，并注明樣品采集時間。選擇合適的室內(nèi)（外）采血空間，受檢者坐（臥）于合適的位置，準(zhǔn)備采血用具、皮膚消毒用品、采血管及試管架、硬質(zhì)廢棄物容器等。2．采集和處理樣品①血漿：將采集的抗凝全血1500～3000r/min離心15min，上層即為血漿，吸出置于合適的容器中，備用。②血清：依據(jù)須要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml靜脈血，室溫下自然放置1～2h，待血液凝固、血塊收縮后再用1500～3000r/min離心15min，吸出血清，置于合適的容器中，備用。3．樣品的保存用于HIV抗體檢測的血清或血漿樣品，短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測的可存放于2～8℃，一周以上應(yīng)存放于-20℃以下。艾滋病檢測篩查試驗室檢測的篩查陽性樣品應(yīng)剛好送確證明驗室，而篩查陰性樣品，可依據(jù)具體須要確定保存時間，建議至少保存1～2個月。特殊用途或?qū)ｍ楉椖康臉悠芬罁?jù)具體要求確定保存時間。4．樣品的運(yùn)輸依據(jù)符合生物平安要求；要獲得相應(yīng)部門批準(zhǔn)并由具有資質(zhì)的人員專程護(hù)送。應(yīng)接受三層容器對樣品進(jìn)行包裝，隨樣品應(yīng)附有與樣品唯一性編碼相對應(yīng)的送檢單。送檢單應(yīng)標(biāo)明受檢者姓名、樣品種類等信息，并應(yīng)放置在其次層和第三層容器之間。1．初篩試驗依據(jù)檢測目的選用符合要求的篩查試劑對樣品進(jìn)行初篩檢測，對呈陰性反應(yīng)的樣品，可出具HIV抗體陰性（-）報告；對呈陽性反應(yīng)的樣品，須要進(jìn)一步做復(fù)檢試驗和確證試驗。篩查程序2．復(fù)檢試驗對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品，應(yīng)運(yùn)用原有試劑和另外一種不同原理（或廠家）的試劑，或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進(jìn)行復(fù)檢試驗。假如初篩檢測運(yùn)用抗原抗體聯(lián)合試劑，則復(fù)檢必需包括一種抗原抗體聯(lián)合試劑。如兩種試劑復(fù)檢均呈陰性反應(yīng)，則報告HIV抗體陰性（-）；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確證明驗室進(jìn)行確證試驗（圖圖HIV抗體篩查檢測流程）。假如抗原抗體聯(lián)合試劑檢測呈陽性反應(yīng)，而抗體試劑檢測為陰性反應(yīng)，則應(yīng)考慮進(jìn)行HIV-1p24抗原或核酸檢測，必要時進(jìn)行隨訪。艾滋病檢測篩查試驗室復(fù)檢判定為陽性反應(yīng)的樣品，確證明驗室可以干脆進(jìn)行確證試驗。3.初篩和復(fù)檢流程圖HIV抗體篩查檢測流程樣品初篩試驗篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗原有試劑或同一試劑商不同原理試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗報告陰性另一不同原理試劑或另外兩種不同試劑商試劑+4．篩查試驗結(jié)果的報告HIV抗體篩查試驗用附表1（見試驗指導(dǎo)教材）進(jìn)行報告，陰性反應(yīng)報告為“HIV抗體陰性（-）”；陽性反應(yīng)報告為“HIV抗體待復(fù)檢”。5．篩查試驗呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送如需送上級試驗室進(jìn)行復(fù)檢，須要核對身份，補(bǔ)充個人信息（如姓名和身份證號碼），必要時采集其次份血樣，持HIV抗體篩查報告，送當(dāng)?shù)匕滩『Y查中心試驗室，或干脆送確證明驗室復(fù)檢。HIV抗體復(fù)檢試驗用附表2（見試驗指導(dǎo)教材）進(jìn)行報告，兩次檢測均陽性或一陰一陽報告為“HIV抗體待確證”；兩次檢測均陰性報告為“HIV抗體陰性（-）”。HIV抗體復(fù)檢報告需由1名檢驗人員和1名審核人員簽字。質(zhì)量限制1．試劑盒內(nèi)部比照試劑盒內(nèi)部比照質(zhì)控品即為試劑盒內(nèi)供應(yīng)的陽性和陰性比照血清。試劑盒內(nèi)部比照用于推斷每次試驗的有效性，但不能作為室內(nèi)質(zhì)控品運(yùn)用。每一次檢測臨床樣品時，必需有試劑盒內(nèi)部比照，而且只能在同批號的試劑盒中運(yùn)用。內(nèi)部比照結(jié)果無效，必需重新試驗。2．室內(nèi)質(zhì)控品為非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測的重復(fù)性而設(shè)置的，包括強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設(shè)置一個弱陽性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2～3倍為宜。外部質(zhì)控品的作用是，推斷該批臨床樣品檢測的有效性，因此，每次試驗必需包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無效，必需重新試驗。室內(nèi)質(zhì)控品可以是商品或試驗室自行制備。3．建立質(zhì)控圖最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings質(zhì)控圖，該圖運(yùn)用累計和技術(shù)或趨勢分析技術(shù)的圖形供應(yīng)系統(tǒng)偏移和漂移的狀況。（1）建立質(zhì)控圖參數(shù)：外部質(zhì)控品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)建立在試驗室常規(guī)運(yùn)用方法對外部質(zhì)控品重復(fù)測定的基礎(chǔ)上。一般接受在不同批次檢測取得至少20個數(shù)據(jù)；如果僅做少量批次的檢測，也至少做5個批次的檢測，每個批次中不少于4個質(zhì)控血清測定結(jié)果，以建立一個臨時性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)達(dá)到20批次數(shù)據(jù)后，替代臨時性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。（2）繪制質(zhì)控圖：質(zhì)控圖是把檢測數(shù)據(jù)與已確定的（計算出的）“限制限”進(jìn)行比較的圖，包含一條中心橫線和其上、下兩條平行的限制線，并按時間依次點入本實驗室每批次試驗質(zhì)控血清的測定值。（3）質(zhì)控規(guī)則及其運(yùn)用:試驗室在報告試驗結(jié)果之前必需評價質(zhì)控數(shù)據(jù)，可通過圖形記錄的檢查或由計算機(jī)審核結(jié)果來確定。目前有很多質(zhì)控規(guī)則，常用的是12S和13S規(guī)則。①告警（12S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出+2s范圍時，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應(yīng)予留意，是否可以接著檢測須要進(jìn)一步視察。若將12S做失控標(biāo)準(zhǔn)，有較高的假失控概率，所以一般不接受。②失控（1