藥物分析第八章

藥物分析第八章第一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)無(wú)菌檢查無(wú)菌技術(shù)指在整個(gè)微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，控制微生物污染的一系列操作方法和措施。包括紫外可見分光光度法無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材無(wú)菌環(huán)境無(wú)菌操作第二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日1、無(wú)菌環(huán)境（1）定義用各種方法控制實(shí)驗(yàn)空間內(nèi)微生物數(shù)量，使其達(dá)到無(wú)菌要求。（2）凈化工作臺(tái)包括無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌柜第三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材包括滅菌器材消毒器材玻璃器皿、接種針、注射器、試管、培養(yǎng)基等凳子。試管架、天平、工作臺(tái)、容器、工作人員手等第四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日一、概述1、概念指檢查藥典要求無(wú)菌藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其它品種是否無(wú)菌的一種方法。2、檢查意義是藥品安全性檢查項(xiàng)目之一，保證人民用藥安全無(wú)菌檢查第五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日包括紫外可見分光光度法燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的軟膏劑與乳膏劑植入劑注射劑眼用制劑燒傷或創(chuàng)傷氣霧劑、噴霧劑、散劑3、范圍不得檢出細(xì)菌、放線菌、霉菌及酵母菌等活菌。第六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日包括需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基（硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基）選擇性培養(yǎng)基一、檢查前的準(zhǔn)備工作（一）培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基第七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日（一）相關(guān)規(guī)定1.檢驗(yàn)數(shù)量一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量2。檢驗(yàn)量一次檢驗(yàn)所用供試品總量三、供試品的檢查

第八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3、陽(yáng)性對(duì)照目的：是檢查陽(yáng)性菌在加入供試品的培養(yǎng)基中能否生長(zhǎng),以驗(yàn)證供試品有無(wú)抑菌活性物質(zhì)和試驗(yàn)條件是否符合要求。4、陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)第九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日包括直接接種法薄膜過(guò)濾法（二）檢查方法第十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日（一）直接接種法1、供試品制備液體試樣固體試樣青霉素類藥放射性藥試樣第十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2、檢查操作取供試品接種→需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基6管陽(yáng)性對(duì)照：金黃色葡萄球菌對(duì)照用菌液1ml另供試品接種→真菌培養(yǎng)基5管30～35℃20～25℃培養(yǎng)7天觀察記錄：是否有菌生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照管在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)有菌生長(zhǎng)

第十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日（二）薄膜過(guò)濾法1、濾器準(zhǔn)備全封閉過(guò)濾系統(tǒng)開放式薄膜過(guò)濾器第十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2、過(guò)濾操作有抗菌供試品→0.9％NaCl→薄膜過(guò)濾無(wú)抗菌供試品→薄膜過(guò)濾陽(yáng)性對(duì)照管：細(xì)菌：30～35℃培養(yǎng)24～48h真菌：20～25℃培養(yǎng)24～72h有菌生長(zhǎng)第十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日四、無(wú)菌檢查結(jié)果判定1、若供試品均澄清或雖顯混濁，但經(jīng)證明無(wú)菌生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照管顯混濁有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照管澄清符合規(guī)定2.如供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長(zhǎng)不符合規(guī)定第十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)藥品的微生物限度檢查一、概述1、定義系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。2、檢查意義是保證藥品有效性、安全性，保證藥品質(zhì)量的重要錯(cuò)施。第十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3、范圍包括常用口服制劑與一般外用制劑及其原、輔料。4、檢查內(nèi)容（1）染菌量檢查:細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測(cè)定（2）控制菌檢查：大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌

5、限度標(biāo)準(zhǔn)不得撿出控制菌

第十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日5、試驗(yàn)前的準(zhǔn)備1.開啟紫光燈和空氣過(guò)濾裝置，至少30min。檢查環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域進(jìn)行。2.人員穿戴無(wú)菌服，進(jìn)入無(wú)菌操作室。4.操作前乙醇棉球消毒→啟封→檢查瓶蓋、瓶口有無(wú)生霉、長(zhǎng)螨第十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日二、供試液制備1、取樣隨機(jī)抽樣，一般為檢驗(yàn)量的3倍量。每批供試品檢驗(yàn)量一般為10g或10ml2、方法：稀釋處理

第十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日三、檢查法1、細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)通常以每g或每ml供試藥品作為計(jì)量單位

計(jì)數(shù)方法：平皿菌落計(jì)數(shù)法取系列稀釋的供試品接種在適宜的瓊脂平板培養(yǎng)基上，以適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng)，觀察肉眼可見的細(xì)菌霉菌及酵母菌菌落數(shù)第二十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2、控制菌檢查（1）大腸桿菌檢查藥品中檢出大腸桿菌表明該藥受糞便污染，服用后有可能被腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體感染

①原理利用目標(biāo)菌所共有的限定酶作用底物產(chǎn)生的分解產(chǎn)物具有顏色或熒光，以此作為指示系統(tǒng)來(lái)鑒定目標(biāo)菌第二十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日366nm紫外線下觀察左:供試品管中:陽(yáng)性對(duì)照管右:MUG培養(yǎng)基本底對(duì)照管第二十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3、結(jié)果判斷

MUGIndole結(jié)果陰性陰性報(bào)告未檢出大腸桿菌陽(yáng)性陽(yáng)性報(bào)告檢出大腸桿菌陽(yáng)性陰性需要進(jìn)一步做檢查陰性陽(yáng)性需要進(jìn)一步做檢查第二十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日

（2）銅綠假單胞菌檢查（綠膿桿菌）常見化膿性感染菌，可造成眼角膜潰瘍、失明，引起敗血癥等嚴(yán)重疾患

檢驗(yàn)程序增菌→分離→純培養(yǎng)→革蘭染色鏡檢→生化實(shí)驗(yàn)第二十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日

（3）金黃色葡萄球菌檢查（綠膿桿菌）致病力最強(qiáng)，能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥

第二十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日驗(yàn)證：計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。

第二十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日菌種

驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

驗(yàn)證方法

驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。

第二十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日包括平皿法和薄膜過(guò)濾法。（一）細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)目的：檢測(cè)藥物在單位質(zhì)量或體積內(nèi)所存在的活菌數(shù)量，常用平皿法。驗(yàn)證：驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

第二十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日（1）試驗(yàn)組

平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50~100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)慮，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。

第二十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日（2）菌液組

測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組

取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對(duì)照組

若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50~100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。第三十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果判斷

在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。第三十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日操作要點(diǎn)：1.一個(gè)細(xì)菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成，因此供試品中所測(cè)得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單位數(shù)（cfu）2.供試品檢驗(yàn)的全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。3.培養(yǎng)基、稀釋劑、實(shí)驗(yàn)器具等的滅菌，按滅菌法的要求采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。4.作供試品稀釋時(shí)，每一稀釋級(jí)都要更換吸管。5.細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。如菌落極小，不易辨認(rèn)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。第三十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日6.含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵菌數(shù)，并且合并計(jì)數(shù)。7.若同一稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。8.使用滅菌吸管時(shí)，管尖不要接觸可能污染的任何容器或用具。9.供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)振搖后取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。第三十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日10.培養(yǎng)基的分裝量不得超過(guò)容器的2/3以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。11.培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。12.滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25℃防止被污染，可在三周內(nèi)用畢。13.已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，一般開啟后不宜再用，更不要反復(fù)加熱溶化。第三十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日14.注皿時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)在45±1℃，高于45℃時(shí)易造成細(xì)菌受損或致死，低于45℃時(shí)易凝固，影響混勻，因此使用前可用水浴保溫效果較好。15.傾注培養(yǎng)基于平皿中與樣品搖勻時(shí)，切勿濺到皿蓋邊和皿蓋上，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第三十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日16.采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過(guò)濾量不宜過(guò)大，以避免濾膜上的微生物受損傷。第三十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日17.每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過(guò)濾或加至適量稀釋劑中混勻，過(guò)濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法及沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。

第三十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日

18.菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。第三十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)抗生素效價(jià)的微生物測(cè)定法抗生素微生物檢定法是國(guó)際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價(jià)測(cè)定方法。自20世紀(jì)40年代建立至今，在各國(guó)藥典中被普遍采用。雖然伴隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價(jià)測(cè)定已被化學(xué)方法所取代，但由于以下原因：第三十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日微生物檢定法可直觀、特異地反映出抗生素藥品的抗菌活性；多組分抗生素由于不同活性組分生物活性的差異，化學(xué)測(cè)定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分組成、含量和生物活性間的關(guān)系；許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性。

所以抗生素微生物檢定法目前在各國(guó)藥典中仍占有重要地位，且短期內(nèi)化學(xué)分析法不可能取代微生物檢定法。第四十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日

一、概述物理、化學(xué)方法：簡(jiǎn)便、快速，本身純度不高，采用該法會(huì)引起偏差，因此，只有在純度較高時(shí)才用此法。微生物法：原理和臨床應(yīng)用的相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高，需用量較小，廣泛應(yīng)用。第四十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日1.定義－抗生素效價(jià)定義“活性”重量單位：以抗生素中所含特定的抗菌（抗腫瘤細(xì)胞、抗病毒）活性部分的重量作為效價(jià)單位。如堿性抗生素，以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素，以純酸的量作為有效部分的量。第四十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日在抗生素的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用等方面，均以抗生素活性成分的“活性”重量計(jì)量抗生素的效價(jià)單位，采用活性成分的“活性”重量1μg＝1效價(jià)單位的方法表示?？股匦r(jià)以“單位（u）”或“微克（μg）”表示。

第四十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日例：硫酸鏈霉素抗菌活性是以鏈霉素效價(jià)單位表示的，其鏈霉素的效價(jià)單位是以具活性成分鏈霉素堿的“活性”重量表示的，即1鏈霉素效價(jià)單位＝1微克鏈霉素堿，這里是“活性微克”而不是“重量微克”。第四十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日在制成鹽類或其他衍生物后，其相應(yīng)的折算效價(jià)，可以從分子量折算而得。如：硫酸鏈霉素的折算效價(jià)為第四十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為1單位而加以折算。如：青霉素G鈉以青霉素單位也稱牛津單位（Oxfordunit）表示其抗菌活性，最初的定義為“1個(gè)青霉素效價(jià)單位（u）為能在50毫升肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育的最小青霉素劑量”。第四十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日抗生素微生物檢定法可分為：（1）稀釋法（2）比濁法（3）瓊脂擴(kuò)散法（管碟法和打孔法）各國(guó)藥典通常采用后兩種方法測(cè)定抗生素的效價(jià)。

第四十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日1.定義－稀釋法通過(guò)監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，觀察含不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中有無(wú)細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而測(cè)定抗生素最低抑菌濃度（MIC）的方法，常用于新藥研制及臨床藥敏試驗(yàn)等方面。

第四十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日1.定義－比濁法通過(guò)監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，利用分光光度法測(cè)定含不同濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基的濁度，從而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素藥物的含量（效價(jià)）測(cè)定。

第四十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日1.定義－（瓊脂）擴(kuò)散法通過(guò)測(cè)定由不同濃度的抗生素溶液在含有試驗(yàn)菌固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散，而在其表面所產(chǎn)生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素藥物的含量（效價(jià)）測(cè)定。第五十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日抗生素微生物檢定方法比較：

第五十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日定義－管碟法

此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。

第五十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2.原理－抑菌圈的形成兩種互動(dòng)作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散作用；另一種是試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時(shí)間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動(dòng)作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。第五十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2.原理－量反應(yīng)平行線原理量反應(yīng)平行線原理：“在屬量反應(yīng)的指標(biāo)中，當(dāng)對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的作用性質(zhì)相同時(shí)，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的兩條對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)關(guān)系直線相互平行”。第五十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2.原理－量反應(yīng)平行線原理在抗生素微生物檢定法中，一定劑量范圍內(nèi)，抗生素對(duì)數(shù)劑量與其所致抑菌圈的大小呈直線關(guān)系。這就在理論上決定了，（活性）成分相同的標(biāo)準(zhǔn)品與供試品在一定劑量范圍內(nèi)產(chǎn)生的兩條劑量反應(yīng)直線相互平行，符合量反應(yīng)平行線原理的基本要求。第五十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3.檢定方法分類一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）二劑量法（2?2法）三劑量法（3?3法）第五十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日二劑量法（2?2法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各兩個(gè)劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗(yàn)條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對(duì)微生物產(chǎn)生的效力。二劑量法用于抗生素藥品效價(jià)的常規(guī)測(cè)定；3.1管碟法的操作步驟第五十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3.1管碟法的操作步驟

預(yù)試驗(yàn)→試驗(yàn)準(zhǔn)備→雙碟底層的制備→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌層的制備→滴加抗生素溶液→雙碟的培養(yǎng)→抑菌圈的測(cè)量→結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定第五十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定：高劑量濃度溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm。高劑量與低劑量的抑菌圈直徑之差最好不小于2mm。高低劑量之比為2:1（如高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時(shí)，可用4:1的劑量比率）。第五十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日試驗(yàn)準(zhǔn)備：雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無(wú)菌間的紫外消毒等。第六十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日雙碟底層的制備：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，待用。第六十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。第六十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日菌層的制備：菌層培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中添加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。注意制備菌層的速度和平整度。第六十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日滴加抗生素溶液：注意標(biāo)準(zhǔn)品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。每組雙碟至少為8個(gè)，一般為10個(gè)。在每個(gè)雙碟的4個(gè)鋼管中，對(duì)角的兩個(gè)鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個(gè)對(duì)角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。第六十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日雙碟的培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過(guò)三層為宜。第六十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日抑菌圈的測(cè)量：

將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入1：1000新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去，切忌主觀挑選抑菌圈和雙碟，是結(jié)果造成偏離。抑菌圈測(cè)量?jī)x的使用：每組試驗(yàn)雙碟應(yīng)在相同的測(cè)量參數(shù)下進(jìn)行測(cè)量。手工測(cè)量：游標(biāo)卡尺第六十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定：抑菌圈測(cè)量?jī)x提供計(jì)算結(jié)果或手工計(jì)算結(jié)果。第六十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果計(jì)算及判斷可靠性檢驗(yàn)抗生素微生物檢定法前提條件是：標(biāo)準(zhǔn)品S和供試品T各對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)呈直線關(guān)系，且標(biāo)準(zhǔn)品S和供試品T的兩條直線平行?？煽啃詼y(cè)驗(yàn)是利用生物統(tǒng)計(jì)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的量反應(yīng)關(guān)系是否顯著偏離直線、偏離平行。對(duì)在一定概率水平下不顯著偏離直線、不顯著偏離平行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為可靠，所得檢定結(jié)果有意義。

第六十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日重試判定抑菌圈大小的要求可靠性檢驗(yàn)：符合可靠性檢驗(yàn)各項(xiàng)規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算?？尚畔蘼剩汗┰嚻沸r(jià)測(cè)定結(jié)果（PT）的可信限率除特殊規(guī)定外，不得大于5%。實(shí)測(cè)效價(jià)與估計(jì)效價(jià)：試驗(yàn)計(jì)算所得效價(jià)應(yīng)在估計(jì)效價(jià)的±10%以內(nèi)，即：試驗(yàn)所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。效價(jià)測(cè)定結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，需換人加倍復(fù)試。

第六十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日三劑量法（3?3法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各三個(gè)劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗(yàn)條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對(duì)微生物產(chǎn)生的效力。三劑量法用于抗生素藥品的仲裁或標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定。第七十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日基本要點(diǎn)中劑量點(diǎn)的抑菌圈直徑應(yīng)在15～18mm。三個(gè)劑量之比為1:0.8（1.25:1）。點(diǎn)樣每組雙碟至少為9個(gè)，一般為15個(gè)。在每個(gè)雙碟的6個(gè)鋼管中，互相間隔的3個(gè)鋼管分別滴加高、中、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)鋼管內(nèi)分別滴加相應(yīng)的高、中、低濃度的供試品溶液。按SH→TH→SM→TM→SL→TL或TH→SH→TM→SM→TL→SL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、中、低劑量溶液。第七十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日三劑量法雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖S3：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量S2：標(biāo)準(zhǔn)品中劑量S1：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量T3：供試品高劑量T2：供試品中劑量T1：供試品低劑量第七十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日抑菌圈的測(cè)量雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量每組試驗(yàn)雙碟抑菌圈的直徑。結(jié)果計(jì)算及可靠性檢驗(yàn)第七十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日管碟法特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：基本操作和設(shè)計(jì)適用于各種抗生素，試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定；樣品用量少，靈敏度高；適合于大批樣品的測(cè)定。第七十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn):凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果；試驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)，需第二天才有結(jié)果；操作手工化，需熟練人員才能得到較正確的結(jié)果；受擴(kuò)散因素的影響，如培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴(kuò)散速度及效價(jià)強(qiáng)度。第七十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日0個(gè)（cp2000)

1個(gè)（cp2005）22個(gè)（cp2010)比濁法第七十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日濁度法：是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制的作用，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。第七十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日基本原理：細(xì)菌接種于澄清的營(yíng)養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，變渾濁，其渾濁程度與細(xì)菌數(shù)的增加、細(xì)菌群體質(zhì)量的增加和細(xì)菌群體細(xì)胞容積的增大之間存在著直接的關(guān)系。當(dāng)一定的光束照射其已經(jīng)渾濁的液體培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)測(cè)定其透過(guò)率就知道細(xì)菌生長(zhǎng)情況，在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，劑量響應(yīng)為一直線。因此，在劑量響應(yīng)曲線的直線范圍內(nèi)，可設(shè)計(jì)比濁法測(cè)定抗生素含量。第七十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日比濁法的操作步驟：

預(yù)試驗(yàn)→試驗(yàn)準(zhǔn)備→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌液培養(yǎng)基的制備→加抗生素溶液→比色管的培養(yǎng)→菌濃度的測(cè)量→結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定第七十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值在0.3~0.7范圍；高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值的差值大于0.1為佳。第八十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日試驗(yàn)準(zhǔn)備：比色管、攪拌轉(zhuǎn)子、塞子的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無(wú)菌間的紫外消毒等。

第八十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。第八十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日菌液培養(yǎng)基的制備：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入液體培養(yǎng)基的菌液量，注意制備菌液與培養(yǎng)基充分混勻。加抗生素溶液：在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培養(yǎng)基，混勻后，在規(guī)定溫度培養(yǎng).第八十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日菌濃度的測(cè)量：在530nm或其他波長(zhǎng)(580nm)處測(cè)定各比色管的菌液濃度，注意測(cè)定時(shí)間的一致性。結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)結(jié)果第八十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：加菌量的影響：加菌量的多少（0.25%、0.5%、1.0%），影響培養(yǎng)至適宜的菌液測(cè)定濃度所用的時(shí)間，加菌量過(guò)少，則測(cè)定時(shí)可利用的濃度范圍窄。各抗生素各濃度之間的吸收度的差值在0.1以上為佳，此時(shí)菌液對(duì)不同濃度的抗生素敏感，測(cè)定誤差較低。第八十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日比色池的清潔：測(cè)定用的比色管需用硝酸－硫酸（5：95）浸泡并用蒸餾水沖洗干凈，不要有污漬和劃痕，與分光光度計(jì)的試管要匹配，要清除抗生素殘留和清洗液的痕跡，除去纖維等雜質(zhì)。第八十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日時(shí)間的一致性：主要是使每管的培養(yǎng)時(shí)間相等，實(shí)驗(yàn)時(shí)在試管中加入含試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時(shí)可先將培養(yǎng)基冷卻至2～4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養(yǎng)基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養(yǎng)終止時(shí)將各管同時(shí)放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗(yàn)管的培養(yǎng)時(shí)間一致。

第八十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日培養(yǎng)溫度控制：溫度的均勻性直接影響試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)速率。美國(guó)藥典28版中對(duì)管碟法的培養(yǎng)溫度要求為±0.5％，而比濁法的溫度要求±0.1％，更為嚴(yán)格。一般恒溫水浴的各部位仍有差異，應(yīng)有攪拌裝置，使培養(yǎng)溫度均勻。培養(yǎng)管的材質(zhì)和管壁的厚度及體積大小應(yīng)均勻一致，若厚薄不均可能影響溫度的傳導(dǎo)，使培養(yǎng)溫度不均一。在水浴中供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的放置位置最好按隨機(jī)區(qū)組分配，以抵消溫度的差異。第八十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日菌液需新鮮配制：當(dāng)天使用，若放在冰箱放置一段時(shí)間后再使用，所測(cè)定的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，誤差大（金葡）。因?yàn)榫涸诜胖靡欢螘r(shí)間后，細(xì)菌老化死亡，但測(cè)定的吸收值不變，從而影響試驗(yàn)時(shí)活菌的量，使結(jié)果產(chǎn)出偏差。注意菌種使用不超過(guò)5代。

第八十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日比濁法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：與管碟法比較，比濁法具有快速，試驗(yàn)過(guò)程3～4小時(shí)，加上其他操作，可在當(dāng)天獲得結(jié)果；采用液體培養(yǎng)基，無(wú)擴(kuò)散因素的影響，試驗(yàn)的靈敏度高，結(jié)果的精密度和正確度都較瓊脂擴(kuò)散法好。第九十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：對(duì)試驗(yàn)儀器的性能及試驗(yàn)器具的要求較高，如培養(yǎng)溫度要求一致，比色管的清潔等。任何影響液體培養(yǎng)基內(nèi)微生物生長(zhǎng)的因素都會(huì)影響抗生素效價(jià)的測(cè)定。第九十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)生化藥物效價(jià)的生物測(cè)定法防病治病的三大藥源：化學(xué)藥物生化藥物生物藥物生物技術(shù)藥物生物制品中藥第九十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日生物藥物：利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理和方法制備的一大類藥物。包括：生化藥物、生物合成藥物、生物制品。第九十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日生化藥物：動(dòng)植物及微生物提取、分離的天然生物活性物質(zhì)及半合成得到生命基本物質(zhì)及其衍生物等。

應(yīng)用前景：方便臨床應(yīng)用；彌補(bǔ)某些藥物的市場(chǎng)空缺；有利于臨床治療；有利于人體健康，前景非常廣闊。第九十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日種類：1.氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類；2.藥用酶類和輔酶類；3.多糖類；4.脂質(zhì)類；5.核酸及其降解物和衍生物類藥物。第九十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日常見的生化藥物：復(fù)合氨基酸、腦多肽、牛纖維蛋白原、水蛭素、生長(zhǎng)素、催乳素、天花粉蛋白、輔酶Q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸軟骨素A、靈芝多糖、透明質(zhì)酸、黃芪多糖、人參多糖、膽酸類、RNA、DNA、ATP、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖腺苷、環(huán)胞苷等。第九十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日生化藥物的特點(diǎn)：1.分子量大，不是定值。肝素（抗凝血）12000～15000（未分級(jí)）低分子肝素（抗血栓）﹤8000（低分子量）右旋糖苷7064000～76000不定值第九十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2.結(jié)構(gòu)確認(rèn)難，需采用生化法確認(rèn)（氨基酸序列分析、肽圖）例：重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液（Ch·P）原液檢定：肽圖：至少每半年檢定一次N-末端氨基酸序列：至少每年檢定一次第九十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日3.需檢查生物活性例：細(xì)胞色素C溶液【檢查】活力照細(xì)胞色素C活力測(cè)定法測(cè)定，不得低于95.0%。尿激酶【檢查】凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)凝血質(zhì)樣活性為零值時(shí)的供試品酶活力，按每1ml中供試品的單位表示，每1ml應(yīng)大于150單位。

第九十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日4.要求檢查安全性5.需做效價(jià)的測(cè)定例：肝素鈉【效價(jià)測(cè)定】照肝素生物測(cè)定法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定，測(cè)得的結(jié)果應(yīng)為標(biāo)示量的91.0%～110.0%檢定用的生物體：新鮮兔血或兔、豬血漿。第一百頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)安全性檢查雜質(zhì)來(lái)源：原料藥（包括制備中間體、副反應(yīng)產(chǎn)物等）輔料及試劑生產(chǎn)工藝降解產(chǎn)物雜質(zhì)特點(diǎn)：化學(xué)結(jié)構(gòu)不清楚

沒有合適的理化檢測(cè)方法

對(duì)生物體可產(chǎn)生特殊的生理作用影響到用藥的安全第一百零一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日一、安全性檢查項(xiàng)目包括：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查熱原檢查異常毒性檢查升壓與降壓物質(zhì)檢查過(guò)敏反應(yīng)檢查溶血與凝聚試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

控制藥品中存在的、可對(duì)生物體產(chǎn)生特殊的生理作用并影響到用藥安全的某些痕量雜質(zhì)。第一百零二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日異常毒性檢查一、方法系將一定劑量的供試品溶液注入小鼠體內(nèi)或口服給藥,在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察小鼠出現(xiàn)的死亡情況,以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法。異常毒性是檢查藥品在生產(chǎn)制造過(guò)程中外來(lái)引入的異物或藥物降解產(chǎn)生的不正常毒性反應(yīng)，主要與生產(chǎn)工藝水平有關(guān)，而不是檢查藥物本身毒性。第一百零三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日二、適用品種生化藥注射劑(如肽、蛋白質(zhì)、酶及輔酶、多糖、脂質(zhì)等)及抗生素類注射劑；某些中藥注射劑；在藥品生產(chǎn)工藝進(jìn)行較大改變后，特別是改變提煉、精制工藝時(shí)，需要在生產(chǎn)過(guò)程中追蹤檢查各工藝段的半成品及成品的毒性試驗(yàn)。第一百零四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日三、相關(guān)進(jìn)展目前異常毒性檢查法僅中國(guó)藥典和英國(guó)藥典有收載；國(guó)外藥典中，對(duì)大多數(shù)生物提取的生化藥或由現(xiàn)代生物技術(shù)得到的組份單一、結(jié)構(gòu)明確的產(chǎn)品,一般不設(shè)定異常毒性檢查項(xiàng)；WHO生物測(cè)定專家委員會(huì)在1997年曾開會(huì)討論異常毒性檢查的必要性問題，認(rèn)為其缺乏專屬性和科學(xué)性，在實(shí)施GMP條件下生產(chǎn)的藥品應(yīng)當(dāng)取消該項(xiàng)檢查。第一百零五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日供試用的小鼠應(yīng)健康合格，體重17～20g在試驗(yàn)前及試驗(yàn)的觀察期內(nèi)，均應(yīng)按正常飼養(yǎng)。做過(guò)本試驗(yàn)的小鼠不得重復(fù)使用。供試品溶液的制備除另有規(guī)定外，用氯化鈉注射液按個(gè)品種項(xiàng)下規(guī)定的濃度制成供試品溶液。檢查法除另有規(guī)定外，取小鼠5只，按各該藥品項(xiàng)下規(guī)定的給藥途徑，每只小鼠分別給予供試品0.5ml。給藥途徑有以下幾種：靜脈注射將供試品溶液注入小鼠尾靜脈，應(yīng)在4～5秒內(nèi)勻速注射完畢。規(guī)定緩慢注射品種可延長(zhǎng)至30秒。第一百零六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日腹腔注射將供試品溶液注入小鼠腹腔。皮下注射將供試品溶液注入小鼠腹部或背部?jī)蓚?cè)皮下。口服給藥將供試品溶液通過(guò)適宜的導(dǎo)管，灌入小鼠胃中。結(jié)果判斷除另有規(guī)定外，5只小鼠在給藥后48h內(nèi)不得死亡。如有死亡，應(yīng)另取體重18～19g小鼠10只復(fù)試，全部小鼠在48小時(shí)內(nèi)不得有死亡。第一百零七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌內(nèi)毒素檢查一、方法：

系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。在GMP條件下，無(wú)內(nèi)毒素即無(wú)熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原，這是用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法的依據(jù)。第一百零八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日二、適用品種：制劑：靜脈注射、鞘內(nèi)注射原料：無(wú)菌分裝原料靜脈注射用的抗生素類原料不可滅菌制劑的原料（如生化藥品、生物制品）制備分裝過(guò)程無(wú)法控制內(nèi)毒素的注射劑的原料第一百零九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日因此，細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來(lái)水中含內(nèi)毒素的量為1至100EU/ml。當(dāng)內(nèi)毒素通過(guò)消化道進(jìn)入人體時(shí)并不產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素通過(guò)注射等方式進(jìn)入血液時(shí)則會(huì)引起不同的疾病。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯細(xì)胞滅活，不造成機(jī)體損害。內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液就會(huì)引起發(fā)熱反應(yīng)—“熱原反應(yīng)”。因此，生物制品類、注射用藥劑、化學(xué)藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類（如一次性注射器，植入性生物材料）必須經(jīng)過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試驗(yàn)合格后才能使用。第一百一十頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日2005年版中國(guó)藥典規(guī)定168個(gè)品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并收錄了2種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：包括凝膠法和光度測(cè)定法兩種方法。凝膠法利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)定性檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素。第一百一十一頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日光度測(cè)定法包括濁度法和顯色基質(zhì)（比色）法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來(lái)定量測(cè)定內(nèi)毒素。比色法又可分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)比色法。檢查時(shí)，可使用任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，一般以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。第一百一十二頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日熱原檢查一、方法系將一定劑量的供試品溶液,靜脈注射家兔體內(nèi),在規(guī)定的時(shí)間內(nèi),觀察家兔體溫升高的情況,以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。熱原檢查是一種限度試驗(yàn)，反映了熱原質(zhì)引起哺乳動(dòng)物復(fù)雜的升溫反應(yīng)過(guò)程，具有直觀、代表性好的優(yōu)點(diǎn)，是一種成熟方法，各國(guó)藥典均有收載。第一百一十三頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日二、適用品種

主要用于生物制品、抗生素、生化藥品類注射劑及在生產(chǎn)過(guò)程中容易被微生物污染或適宜微生物繁殖化學(xué)藥品的注射劑；做靜脈注射的注射液，尤其是劑量較大的靜脈滴注藥，更要注意熱原檢查。某些抗生素、抗腫瘤藥品、放射性藥品等影響家兔正常體溫,因此不適宜采用熱原檢查法。目前存在著細(xì)菌內(nèi)毒素檢查逐步替代熱原檢查的趨勢(shì)。第一百一十四頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日三、熱原檢查熱原通常是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物。磷脂多醇是復(fù)合物的活性中心，致熱作用最強(qiáng)。是能夠致熱的微生物的尸體及其代謝產(chǎn)物，即細(xì)菌的一種內(nèi)毒素。細(xì)菌、霉菌、病毒均可產(chǎn)生熱原。熱原最主要特性為耐熱性，其為由磷脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，存在于細(xì)菌的細(xì)胞和固體膜之間。第一百一十五頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，具很強(qiáng)的熱原活性。熱原具耐熱性、濾過(guò)性、水溶性、不揮發(fā)性、被吸附性。當(dāng)熱原被輸入人體后，約0.5h后，使人發(fā)冷寒戰(zhàn)、高熱、出汗、惡心、嘔吐、昏迷甚至危及生命，可于注射劑滅菌時(shí)根據(jù)其特性徹底破壞熱原。

第一百一十六頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日注入人體的注射劑中含有熱原量達(dá)1μg/kg就可引起不良反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)通常在注入1小時(shí)后出現(xiàn)，可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時(shí)體溫可升至40℃以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時(shí)搶救，可危及生命。該現(xiàn)象稱為“熱原反應(yīng)”。

第一百一十七頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日《中國(guó)藥典》2005年版規(guī)定熱原檢查采用家兔法，由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似，所以用家兔來(lái)檢測(cè)熱原，為保障藥品質(zhì)量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。

第一百一十八頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日供試用的家兔應(yīng)健康無(wú)傷，體重1.7～3.0kg，雌兔應(yīng)無(wú)孕。預(yù)測(cè)體溫前7日即應(yīng)用同一飼料飼養(yǎng),在此期間內(nèi)，體重應(yīng)不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異常現(xiàn)象。每一家兔的使用次數(shù)，用于一般藥品的檢查，不應(yīng)超過(guò)10次。

第一百一十九頁(yè)，共一百三十頁(yè)，2022年，8月28日試驗(yàn)前的準(zhǔn)備

在作熱原檢查前1～2日，供試用家兔應(yīng)盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于5℃，實(shí)驗(yàn)室的溫度應(yīng)在17～25℃,在試驗(yàn)全部過(guò)程中，應(yīng)注意室溫變化不得大于3℃，防止動(dòng)物騷動(dòng)并避免噪音干擾。家兔在試驗(yàn)前至少1小時(shí)開始停止給食并置于適宜的裝置中，直至試驗(yàn)完畢。

試驗(yàn)用的注射器、針頭及一切和供試品溶液接觸的器皿,應(yīng)置烘箱中用25