微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座

教學(xué)重點微生物分類單元與命名

微生物分類方法

微生物分類系統(tǒng)微生物判定方法

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第1頁

微生物分類學(xué)是研究微生物分類理論和技術(shù)方法科學(xué)。其目標(biāo)是研究各類微生物特征及其親緣關(guān)系，為微生物資源利用、控制和改造提供理論依據(jù)。其內(nèi)容包含

分類（classification）

判定(identification)和

命名(nomenclature)3部分。

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第2頁當(dāng)前，已記載過生物種數(shù)約為150余萬種，其中微生物為10～20萬種，而且還在急劇擴(kuò)大。

分類是依據(jù)一定標(biāo)準(zhǔn)對微生物分群歸類，依據(jù)相同性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并描述各個類群特征。

判定是指借助于現(xiàn)有微生物分類系統(tǒng)，經(jīng)過特征測定，確定某一微生物應(yīng)歸屬類群過程，經(jīng)過判定可到達(dá)知類、辨名目標(biāo)。

命名是依據(jù)國際命名法規(guī)，為一個未著名字新培養(yǎng)物確定其學(xué)名過程。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第3頁

生物種類極其繁多。據(jù)預(yù)計，當(dāng)前人們已判定命名約有200萬種，其中微生物約有20萬種。生物分類標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)表型特征依據(jù)生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平

形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)、生態(tài)學(xué)等。重在應(yīng)用，不包括進(jìn)化和親緣關(guān)系。

探尋進(jìn)化關(guān)系，反應(yīng)生物系統(tǒng)發(fā)育過程。微生物分類學(xué)是研究微生物分類理論和方法學(xué)科。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第4頁第一節(jié)微生物分類單元與命名

一、微生物分類單元

分類單元（taxon，復(fù)數(shù)taxa）是指某一個詳細(xì)分類群，如原核生物界（Procaryotae）中大腸埃希氏菌屬（Escherichia）和枯草孢桿菌（Bacillussubtilis）等分別代表一個分類單元。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第5頁（一）種以上分類單元界

（Kingdom）

門

（Phylum）

綱（Class）

目（Order）

科（Family）

屬（Genus）

種（Species）

微生物分類目標(biāo)：把各種微生物按照它們親緣關(guān)系分群歸類，排成系統(tǒng)，方便于人們對微生物進(jìn)行判定和交流。分為7個基本分類單元，由上而下一次為：微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第6頁

種（species）

微生物種是表型特征高度相同、親緣關(guān)系極其靠近與其它種有顯著差異一群菌株總稱。

在詳細(xì)分類時，慣用一個被指定能代表這個種群模式菌株或經(jīng)典菌株（typestrain）作為該種模式種（typespecies）來定種，模式種往往是定為一個新屬第一個種或第一批種之一，也能夠是在某一已知屬內(nèi)任意指定種。

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第7頁（二）種以下分類單元1.亞種（subspecies，縮寫為subsp．）亞種是種深入細(xì)分單位，普通指一顯著而穩(wěn)定特征與模式種不一樣但又不足以區(qū)分為新種菌株類群。

2.變種（Variety，縮寫為var．）變種與亞種同義，近已廢止。是指在一些（通常是較少）方面與特定經(jīng)典種對應(yīng)特征有所不一樣菌株。3．“型”（type）型是同種之內(nèi)在一些特殊性質(zhì)上有區(qū)分類群。它們之間區(qū)分不象亞種那樣顯著，曾用于亞種以下細(xì)分，但當(dāng)前已廢除

。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第8頁

培養(yǎng)物(culture)：

一定時間一定空間內(nèi)微生物細(xì)胞群或生長物。如微生物斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物等。4.菌株（strain）菌株又稱品系。一個菌株是指由一個單細(xì)胞繁衍而來克?。╟lone）或無性繁殖系中一個微生物或微生物群體。假如用試驗方法（如經(jīng)過誘變）所取得某一菌株變異型，則能夠稱為一個新菌株，方便與原來菌株相區(qū)分。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第9頁二、微生物分類單元命名

微生物種名命名和其它高等生物一樣，采取林奈創(chuàng)建“雙名法”。屬名在前，普通用拉丁字名詞表示，字首字母大寫。種名在后，慣用拉丁文形容詞表示，全部小寫。

學(xué)名=屬名+種名+（首次定名人）+現(xiàn)名定名人+定名年份

必要、用斜體字

可省略，均用正體字微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第10頁

Bacillussubtilis

（Ehrenberg）Cohn1872例：StaphylococcusaureusRosenbach1884微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第11頁

如：cillusthuringiensissubsp．Galleria學(xué)名=屬名+種名+（Subsp．或var．）+亞種（或變種）名

亞種（subspecies，縮寫subsp．）或變種（variety，縮寫var．）采取三名法：用斜體字用正體字，可省略用斜體字微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第12頁第二節(jié)微生物分類判定方法

一、經(jīng)典分類法

（一）形態(tài)特征：1.個體形態(tài)：大小，形態(tài)，分化，結(jié)構(gòu)，染色等。

2.群體形態(tài)：培養(yǎng)特征反應(yīng)，菌落和液體培養(yǎng)特征。

（二）生理生化特征1.營養(yǎng)特征：能否利用多糖、雙糖、單糖、脂肪酸CO2作為碳源和能源；能否利用蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸、銨鹽等。

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第13頁2．代謝產(chǎn)物

如經(jīng)過檢驗微生物能否產(chǎn)生有機(jī)酸、乙醇、碳?xì)浠衔?、氣體及硫化氫等；能否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚；能否分解糖，能否產(chǎn)生色素、抗生素等。3．酶活性

觀察是否有氧化酶、接觸酶、脲酶、凝固酶等。常測定有淀粉水解、油脂水解、酪素水解、明膠液化等項目。4．在牛乳培養(yǎng)基中生長反應(yīng)

有些使牛乳中乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，致蛋白質(zhì)凝固；有些具蛋白酶，使酪蛋白分解為蛋白胨（胨化）；另一些細(xì)菌則把牛乳中含氮物質(zhì)分解成氨，使牛乳變成堿性。所以，可觀察牛乳中是凝固還是胨化，是產(chǎn)酸還是產(chǎn)堿判定細(xì)菌。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第14頁（三）生態(tài)特征微生物對氧氣、溫度、酸堿度、鹽度等環(huán)境原因要求也是分類依據(jù)。（四）對噬菌體和藥品敏感性

噬菌體有嚴(yán)格寄主范圍，它不但對種有特異性，而且對同種細(xì)菌不一樣型也有特異性。經(jīng)過觀察噬菌斑形狀、大小，在液體培養(yǎng)基中，是否使由混濁變?yōu)槌吻宓茸鳛榕卸ㄒ罁?jù)。(五)血清學(xué)反應(yīng)

慣用已知菌種、型或菌株制成抗血清(抗體)，與待判定對象(抗原)是否發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)來判定未知菌種、型或菌株。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第15頁

二、化學(xué)分析法

（一）細(xì)胞壁化學(xué)成份

如G—細(xì)胞壁肽聚糖含量少，有較多脂蛋白、脂多糖，而G+菌細(xì)胞壁肽聚糖含量多，含有磷壁酸。革蘭氏G+菌中，不一樣菌種肽聚糖含量差異很大(30%～95%)，結(jié)構(gòu)和組分上也因菌種而異。

（二）全細(xì)胞水解液糖型

放線菌全細(xì)胞水解液糖型可分為①阿拉伯糖，②半乳糖，③無糖，④木糖和阿拉伯糖4類。

（三）脂肪酸組成

經(jīng)過氣-液相質(zhì)譜分析測定微生物所含飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸組成差異。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第16頁

（四）磷脂、醌、多胺分析

磷脂

磷脂種類很多，其中有5種可作為判定指標(biāo)：磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甲基乙醇胺(PME)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油(PG)和一個含葡萄糖胺未知結(jié)構(gòu)磷脂。

醌

用于細(xì)菌分類主要是甲基萘醌（menaquinone，即VitK）和泛醌（ubiquinone，即輔酶Q）。甲基萘醌用于放線菌與革蘭氏陽性菌分類。

多胺

用經(jīng)典分類方法不易區(qū)分，但用多胺分析能快速區(qū)分。

如黃單胞菌屬（Xanthomonas）與植物致病假單胞菌及一些腐生假單胞菌，大多數(shù)特征都一樣，前者主要是亞精胺，后者主要是腐胺。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第17頁

利用高度標(biāo)準(zhǔn)化SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析，對支原體、細(xì)菌、放線菌和真菌判定。大量研究表明全細(xì)胞蛋白質(zhì)分析和DNA-RNA雜交有高度相關(guān)性，故此法可用于種和種以下分類判定。慣用電泳方法有單向電泳和

雙向電泳，并應(yīng)用特定計算機(jī)軟件對電泳圖譜進(jìn)行分析。（五）蛋白質(zhì)分析微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第18頁三、遺傳特征分類法

（一）DNA堿基組成[(G+C)mol%]

不一樣種微生物DNA堿基對排列次序不一樣，其(G+C)mol%值普通隨種不一樣而改變。普通認(rèn)為，親緣關(guān)系相近種，其堿基對排列次序相近，其(G+C)mol%值也靠近。但(G+C)mol%值靠近兩個種親緣關(guān)系則不一定靠近。2.5%～4.0%同種；

＜2%無分類學(xué)上意義；

＞5%兩個不一樣種；

＞10%不同屬

。方法:熱變性溫度法、浮力密度法和高效液相色譜法。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第19頁

（二）核酸雜交法

不一樣微生物DNA堿基排列次序異同直接反應(yīng)它們之間親緣關(guān)系，堿基排列次序差異越小，它們之間親緣關(guān)系越近，反之亦然。

因為堿基正確排列次序不能由DNA(G+C)mol%值反應(yīng)微生物親緣關(guān)系，所以，當(dāng)前分類學(xué)主要采取較為間接比較方法——核酸雜交（nucleicacidhybridization），來比較不一樣微生物DNA中堿基排列次序相同程度，以進(jìn)行微生物分類。

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第20頁

1.DNA-DNA雜交

原理：在高溫條件下，DNA雙鏈離解成單鏈（變性），降溫（退火）后互補(bǔ)單鏈又能夠重新結(jié)合形成雙鏈DNA（復(fù)性）。依據(jù)DNA這個特征，將兩個不一樣細(xì)菌單鏈變性DNA混合，假如：

結(jié)合成完整雙鏈——雜交率為100%。同源程度很高，其堿基次序完全相同；

部分結(jié)合，雜交率小于100%。同源程度不高，

則單鏈會形成不一樣微生物之間。

不一樣微生物之間，DNA同源程度越高，其雜交率就越高。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第21頁

DNA-DNA分子雜交測定核酸同源性原理微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第22頁＜20%不一樣菌屬；20%～60%屬內(nèi)親密相關(guān)種；＞60%

同種；＞70%同一亞種。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第23頁2.DNA–rRNA雜交

當(dāng)兩個菌株DNA非配對堿基超出10%～20%時，DNA-DNA雜交往往不能形成雙鏈，因而限制DNA–DNA雜交主要用于種水平上分類。

比較親緣關(guān)系更遠(yuǎn)菌株之間關(guān)系，需要用rRNA與DNA雜交。rRNA是DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。rRNA-DNA雜交也能夠顯示不一樣細(xì)菌堿基次序相同程度，因為rRNA堿基次序與一股單鏈DNA堿基次序互補(bǔ)。DNA同源性很低兩菌株，DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時，用DNA-rRNA雜交，仍可表現(xiàn)出較高雜交率，故能夠比較親緣關(guān)系較遠(yuǎn)菌株間關(guān)系，進(jìn)行屬及屬以上分類單元分類。DNA-rRNA雜交與DNA–DNA雜交原理和方法基本相同。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第24頁3.核酸探針

核酸探針（probe）是指能特異識別特異核苷酸序列、帶有標(biāo)識一段單鏈DNA或RNA分子。換句話說，它是能與被檢測特定核苷酸序列（靶序列）互補(bǔ)結(jié)合，而不與其它序列結(jié)合帶標(biāo)識単鏈核苷酸片段。

依據(jù)特異性不一樣，核酸探針在微生物判定與檢測中作用也不一樣，有探針只用于某一菌型檢測，有可用于某一個、屬、科至更大類群范圍微生物檢測或判定。

核酸探針

分為基因組DNA探針、RNA基因（cDNA）探針、RNA探針和人工合成寡核苷酸探針等。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第25頁

（三）16SrRNA寡核苷酸分類目錄

即16SrRNA寡核苷酸序列比較分析?，F(xiàn)已被公認(rèn)為是碩士物進(jìn)化適當(dāng)方法。主要原因是：

（1）16SrRNA普通存在于原核生物和真核生物細(xì)胞中，可用以比較它們在進(jìn)化上關(guān)系；

（2）16SrRNA有主要并恒定生理功效；

（3）rRNA基因在細(xì)胞中是穩(wěn)定，不會轉(zhuǎn)移；

（4）16SrRNA分子一些堿基次序非常保守，同時又有可變區(qū)段，可用作探索生物主要進(jìn)化歷程；

（5）16SrRNA在細(xì)胞中含量大易于提取，分子量（1540bp）適中，且信息量大又易于分析。所以，16SrRNA是理想研究材料。

微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第26頁16SrRNA寡核苷酸編目分析依據(jù)原理：用一個核糖核酸酶水解rRNA，可產(chǎn)生一系列寡核苷酸片斷。假如兩種或兩株微生物親緣關(guān)系越靠近，則它們產(chǎn)生寡核苷酸片斷次序也越近，反之亦然。

古菌域這個“第三界生物”正是基于16SrRNA寡核苷酸序列比較分析而確定。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第27頁四、數(shù)值分類法20世紀(jì)60年代，隨計算機(jī)應(yīng)用而發(fā)展細(xì)菌分類方法。它對細(xì)菌各種生物學(xué)性狀按“等主要標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行分類，普通需選取50項以上形態(tài)、生理、生化、遺傳、生態(tài)和免疫特征等指標(biāo)逐一進(jìn)行比較，經(jīng)過計算機(jī)分析各菌間相同度，劃分細(xì)菌屬和種，并確定它們親緣關(guān)系。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第28頁

數(shù)值分類可大致分為5個步驟：

1.確定分類單位和選擇分類特征：數(shù)值分類最低等級分類單位稱操作分類單位（OTU），OTU能夠是菌株、種或?qū)俚取?/p>

選擇50個以上乃至幾百個，

所選性狀盡可能包含微生物各個方面。

2.性狀編碼：將試驗測得結(jié)果

，如陽性用“+”表示，陰性用“-”表示，轉(zhuǎn)化成計算機(jī)能識別、運算符號并編碼后，把它們排列成序號，形成一個性狀（原始數(shù)據(jù)）矩陣，然后分別用1（陽性）和0（陰性）符號輸入計算機(jī)。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第29頁3.計算兩菌株間相關(guān)系數(shù)：計算機(jī)利用專門編寫程序，對OTU進(jìn)行兩兩比較，最終計算出OTU之間總相同系數(shù)。

4.列出相同度矩陣：由計算機(jī)計算各OTU之間相同性并依據(jù)相同性數(shù)值進(jìn)行聚類分析、分群歸類，得到相同度矩陣，即S矩陣。比如我們對10個菌株進(jìn)行數(shù)值分類，經(jīng)過系統(tǒng)聚類得到圖AS矩陣，相同度為百分?jǐn)?shù)，100表示每個OTU自己與自己相比，自然全同。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第30頁

將相同度高和低分別列在一起，結(jié)果得到圖B

所表示矩陣。

10個菌株相同度矩陣

對10個菌株進(jìn)行數(shù)值分類，經(jīng)過系統(tǒng)聚類得到圖AS矩陣微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第31頁5.系統(tǒng)聚類和結(jié)果表示：數(shù)值分類結(jié)果可用各種方法表示，其中樹狀譜圖因為直觀明確而最慣用。從圖A所表示S矩陣看不出這10個菌株相互關(guān)系，所以需要對矩陣進(jìn)行重新處理，將相同度高和低分別列在一起，結(jié)果得到圖B所表示矩陣再轉(zhuǎn)換成能顯示這10個菌株相互關(guān)系樹狀譜(圖C)。

因為數(shù)值分類法是按大量表型特征總相同性進(jìn)行分類，故其結(jié)果不可能直接反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育自然規(guī)律，所以，由數(shù)值分類法取得類群只能稱為表元（phenon）或表觀群（phenoticgroup），而不能當(dāng)做嚴(yán)格分類單元。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第32頁

圖C10個菌株間相同度樹狀譜

虛線表示各菌株相同度水平，可用作屬與種兩個不一樣層次分類單元微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第33頁第三節(jié)微生物分類系統(tǒng)一、生物界級分類學(xué)說兩界系統(tǒng)三界系統(tǒng)四界系統(tǒng)五界系統(tǒng)六界系統(tǒng)微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第34頁微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第35頁20世紀(jì)70年代末美國伍斯（Woese）等人對大量微生物和其它生物進(jìn)行16SrRNA（或18SrRNA）寡核苷酸測序，并比較其同源性水平后，首次提出了生命第三種形式——古菌存在。

隨即他及其同事們又對大量菌株進(jìn)行16SrRNA（或18SrRNA）序列研究，相繼發(fā)覺極端啫鹽菌和極端嗜酸嗜熱菌也和產(chǎn)甲烷菌一樣，含有既不一樣于其它細(xì)菌也不一樣于真核生物序列特征，而它們之間則含有許多共同序列，從而提出了三域?qū)W說（ThreeDomainsTheory），即將生物分為三域：古菌域、細(xì)菌域和真核生物域。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第36頁

系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)

經(jīng)過比較生物大分子序列差異數(shù)值構(gòu)建系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹，其特點是用一個樹狀分枝圖型來概括各種(類)生物之間親緣關(guān)系。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第37頁系統(tǒng)發(fā)育樹微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第38頁1.提出了一個全新正確衡量生物間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方法；

2.對探索生命起源及原始生命發(fā)育進(jìn)程提供了線索和理論依據(jù)3.突破了細(xì)菌分類僅靠形態(tài)學(xué)和生理生化特征限制，建立了全新分類理論；4.為微生物生物多樣性和微生物生態(tài)學(xué)研究建立了全新研究理論和研究方法，尤其是不經(jīng)培養(yǎng)直接對生態(tài)環(huán)境中微生物進(jìn)行研究。

意義：微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第39頁一、細(xì)菌分類系統(tǒng)

《伯杰氏手冊》最初是由美國賓夕法尼亞大學(xué)細(xì)菌學(xué)教授伯杰（D.Bergey）（1860—1937）及其同事為細(xì)菌判定而編寫，第1版名為《伯杰氏判定細(xì)菌學(xué)手冊》（Bergey’sManualfoDeteminativeBacteriology）。該書自1923年第1版問世以來，已進(jìn)行過8次修改，現(xiàn)已發(fā)行第9版。伯杰氏手冊:是當(dāng)前進(jìn)行細(xì)菌分類、判定最主要參考書，其特點是描述非常詳細(xì)，包含對細(xì)菌各個屬種特征及進(jìn)行判定所需做試驗詳細(xì)方法。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第40頁第一版(《系統(tǒng)手冊》)1984年問世，至1989年出齊，共4卷。1994年又將《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》1～4卷中相關(guān)屬以上分類單元分類判定資料進(jìn)行少許修改補(bǔ)充后聚集成一冊仍用原來書名出版，故稱《伯杰氏判定細(xì)菌學(xué)手冊》第9版。

第二版《系統(tǒng)手冊》

分5卷，將從年起陸續(xù)出版。第2版與第1版最大區(qū)分，是將原核生物分為古菌域和細(xì)菌域，主要是基于分子系統(tǒng)發(fā)育資料而不是表型特征。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第41頁

《系統(tǒng)手冊》第1版共分4卷：第一卷：普通醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)方面主要革蘭氏陰性

細(xì)菌，共分11個組。

第二卷：放線菌以外革蘭氏陽性細(xì)菌，分6個組。

第三卷：光合細(xì)菌、古細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌及其它革蘭氏

陽性細(xì)菌，分8個組。第四卷：放線菌，分8個組。微生物的分類醫(yī)學(xué)知識專家講座第42頁《系統(tǒng)手冊》第2版

內(nèi)容為：第一卷：1～14組，包古菌、藍(lán)細(xì)菌、光合細(xì)菌和最

早分支屬。第二卷：15～19組，包含變形桿菌（屬G-真細(xì)菌類）。第三卷：20～22組，包含低（G+C）mol%G+菌。第四卷：23組，包含高（G+C）mol%值G+菌（放

線菌類及相關(guān)G+菌）。第五卷：24～30組，包含浮霉?fàn)罹⒙菪w、絲桿菌、

擬桿