細菌內(nèi)毒素檢查法

細菌內(nèi)毒素檢查法第一頁，共四十四頁，2022年，8月28日一、基本概念細菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系熱原(Progen)

指臨床上能使哺乳類動物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。關(guān)于熱原的定義在學(xué)術(shù)上還有爭論。細菌內(nèi)毒素(Endotxin)

革蘭氏陰性細菌細胞壁的構(gòu)成成分，具有多種生物活性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖(LPS)。熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭論，但在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就控制熱原。第二頁，共四十四頁，2022年，8月28日一、基本概念細菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中的細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方式，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)。第三頁，共四十四頁，2022年，8月28日一、基本概念細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU或IU)表示。細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。第四頁，共四十四頁，2022年，8月28日一、基本概念細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗無干擾的滅菌注射用水。試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤30分鐘以上，也可以采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。第五頁，共四十四頁，2022年，8月28日二、細菌內(nèi)毒素檢查法(凝膠限量法)細菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）實驗程序如下：一、實驗準(zhǔn)備：試劑、儀器、及用具等二、確定藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）三、計算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）四、鱟試劑靈敏度復(fù)核五、藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗六、供試品干擾試驗以及干擾試驗的驗證七、供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。第六頁，共四十四頁，2022年，8月28日三、實驗準(zhǔn)備1.儀器、設(shè)備

37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具2.器具：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)除熱原處理（250℃干烤30min以上）;塑料用具須確證不干擾實驗結(jié)果.3.試劑內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、鱟試驗用水、

PH調(diào)節(jié)劑。

第七頁，共四十四頁，2022年，8月28日四、確定藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）L=K/ML:供試品的內(nèi)毒素限值,可從《藥典》上查詢或按以上公式計算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照規(guī)定的給藥途徑,人體每公斤體重每小時可接受的最大內(nèi)毒素劑量,以EU/(kg.h)表示;M:人體每公斤體重每小時最大用藥劑量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中國人均體重按60公斤計算，人體表面積按1.62m2計算。按注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M)。第八頁，共四十四頁，2022年，8月28日五、鱟試劑靈敏度復(fù)核

1.鱟試劑靈敏度定義：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。2.目的

2.1考察鱟試劑靈敏度和細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價是否準(zhǔn)確，

2.2考察試驗人員操作方法是否正確和試驗條件是否符合規(guī)定。3.鱟試劑靈敏度復(fù)核的條件

3.1使用新批號的鱟試劑，

3.2試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時。第九頁，共四十四頁，2022年，8月28日五、鱟試劑靈敏度復(fù)核4.溶液配制

注：A為內(nèi)毒素水溶液系列；B為陰性對照編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ

4

444B無／檢查用水---------------2第十頁，共四十四頁，2022年，8月28日五、鱟試劑靈敏度復(fù)核5.反應(yīng)加樣6.結(jié)果判斷：反應(yīng)管倒轉(zhuǎn)180°

陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：無凝膠或凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者內(nèi)毒素濃度(EU／ml)2λλ0.5λ0.25λNC0.1ml鱟試劑○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日五、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗有效性判斷

NC管必須全部為陰性(--)TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

符合以上條件試驗有效第十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日五、鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果計算鱟試劑靈敏度的測定值(λc)計算：

λc=antilg(∑X／4)X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)0.5λ≤λc≤2λ時，以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。第十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度的選擇

一般為了試驗的方便，選擇靈敏度低的鱟試劑，若供試品的限值很小，則應(yīng)選擇靈敏度高的鱟試劑，方便供試品溶液的稀釋和PPC（供試品陽性對照）的制備。

第十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日七、供試品溶液的制備供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計算

MVD＝CL/λL:供試品的內(nèi)毒素限值；

C：供試品溶液的濃度；當(dāng)L以EU/ml表示時，C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當(dāng)L以EU/ml表示時，C的值不是樣品的濃度，就是1)。第十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日七、供試品溶液的制備某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。(USP、EP一般要求供試品溶液與鱟試劑的混合液的PH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。）

對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需要調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的PH值。第十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日

八、藥品與鱟試劑相容性初篩試驗1.目的：通過一系列濃度的試驗，篩選出對鱟試驗無干擾的濃度2.作用：確定以后對樣品作BET常規(guī)檢查的兩個主要參數(shù)：樣品的有效稀釋范圍或有效濃度范圍，可選擇的鱟試劑的靈敏度范圍。減少干擾試驗的盲目性節(jié)省時間以及成本。第十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日九、供試品的干擾試驗1.目的：判斷某種檢品在某種濃度下是否適合作內(nèi)毒素檢查。2.原理：比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進行和在檢品中進行的差異,也即是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進行反應(yīng)的差異,無差異即無干擾,有差異即有干擾。若沒有干擾，該濃度可以進行日常檢查；若有干擾，則必須排除干擾后才能進行日常檢查。第十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日九、供試品的干擾試驗3.在何種情況下需做干擾試驗：新品種建立方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變試驗環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗結(jié)果的變化。第十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日九、供試品的干擾試驗編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/檢查用水---------------2B2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/供試品溶液---------------2①注：A為陰性對照；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為供試品溶液①

USP、EP規(guī)定為4支平行管凝膠法干擾試驗溶液的制備第二十頁，共四十四頁，2022年，8月28日九、供試品的干擾試驗加樣反應(yīng)NCB溶液(PC系列)C溶液(PPC系列)供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu／ml)----2λλ0.5λ0.25λ2λλ0.5λ0.25λ----平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第二十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析

試驗有效性判斷

---NC管必須全部為陰性

---供試品管必須為陰性

---TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，

0.25λ管均為陰性(----)

即0.5λ≤Es≤2λ

符合以上條件試驗有效。

λ

第二十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析按下式計算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es和Et)Es=antilg(∑Xs／4)Et=antilg(∑Xt／4)Xs和Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。USP、EP規(guī)定當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第二十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果1(SD表示供試品溶液)E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NCEs

++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPCEt

++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Es=Et,干擾成立第二十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果2：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++----------0.25Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且Et=2Es,干擾成立第二十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果3：E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt++++++++++++------0.125Eu／ml

0.5λ≤Es≤

2λ且

Et

=0.5Es,干擾成立第二十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果4：增強E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++----------0.25Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國藥典判斷：試驗有效，但內(nèi)毒素供試品溶液系列不符合0.5Es≤Et≤2Es

，則認(rèn)為干擾試驗不成立，即供試品在試驗濃度下有干擾作用。

按USP、EP判斷:內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認(rèn)為干擾試驗不成立，即供試品在試驗濃度下有干擾作用。第二十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果5：增強E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt+++++++++++++-----0.104Eu／ml按中國藥典判斷:試驗有效，符合0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，則認(rèn)為干擾試驗成立,即供試品在試驗濃度下無干擾作用。按USP、EP判斷:

內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求，則認(rèn)為干擾試驗不成立,即供試品在試驗濃度下有干擾作用。第二十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果6：抑制E0.5

E0.25

E0.125

E0.06NC

++++++++----------SDE0.5

SDE0.25

SDE0.125

SDE0.06NPC

+++---------------

內(nèi)毒素供試品溶液系列2λ管（SDE0.5）中有一管呈陰性，供試品在該濃度下對凝膠反應(yīng)有抑制作用。第二十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日十、干擾試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果7：抑制E0.5E0.25E0.125E0.06NCEs++++++++++++------0.125Eu／mlSDE0.5SDE0.25SDE0.125SDE0.06NPCEt

++++--------------0.5Eu／ml按中國藥典:0.5λ≤Es≤

2λ但

Et

＞2Es,干擾不成立。認(rèn)為供試品在試驗濃度下對凝膠反應(yīng)有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤Es≤

2λ且0.5λ≤

Et≤

2λ

干擾成立。認(rèn)為供試品在試驗濃度下對凝膠反應(yīng)無干擾作用.第三十頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗1.試劑試劑名稱廠家規(guī)格靈敏度或效價數(shù)量鱟試劑湛江安度斯0.1ml/支0.25Eu/ml36支工作標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品檢驗所-------150EU/支1支BET水湛江安度斯50ml/瓶-------------PH調(diào)節(jié)劑湛江安度斯2ml/支-------1支某產(chǎn)品-------100ml:0.4g-------1瓶第三十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗2.制備某產(chǎn)品供試品溶液某產(chǎn)品內(nèi)毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀釋倍數(shù)MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6選擇稀釋倍數(shù)為8倍,則其供試液的濃度為0.5mg/ml。供試液(S8)的制備

2.0ml供試品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0第三十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗3.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)毒素供試品溶液的制備：分別用鱟試劑和供試品溶液將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按以下步驟稀釋：

0.2ml0.2ml1.0ml

150EU/ml15EU/ml1.5EU/ml0.5EU/ml1.8ml1.8ml2.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml1.0ml1.0ml第三十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗4.反應(yīng)結(jié)果NCB溶液(PC系列)反應(yīng)終點濃度C溶液(PPC系列)反應(yīng)終點濃度供試品管內(nèi)毒素濃度(Eu╱ml)---0.50.250.1250.060.50.250.1250.06----平行管-++--0.25++--0.25--++--0.25++--0.25-／++--0.25+---0.5／／++--0.25++--0.25／反應(yīng)條件37±1℃，60min±2min第三十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗

5.結(jié)果分析試驗有效性判斷：

NC管必須全部為陰性

NPC管必須全部為陰性

TAL與內(nèi)毒素水溶液系列：

2λ管均為陽性(++++)，0.25λ管均為陰性(----)

試驗結(jié)果符合以上條件，試驗有效。

λ

第三十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗按下式計算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es和Et)

Es=antilg(∑Xs／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×4)／4］=0.25Eu／mlEt=antilg

(∑Xt／4)=antilg［(lg0.25Eu／ml×3+lg0.5Eu／ml)／4］=0.297Eu／ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es

，供試品在0.5mg／ml濃度下無干擾作用。第三十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日十二、消除干擾的方法

供試品若經(jīng)干擾試驗證實存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。

1.供試品稀釋法

MVD=CL/λ

鱟試劑靈敏度(λ)越高(數(shù)值越小)，供試品的稀釋倍數(shù)越大，干擾越小。第三十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日十二、消除干擾的方法

2.物理方法如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇)3.化學(xué)方法如調(diào)節(jié)PH值(奎諾酮類)、調(diào)節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP)4.生物方法如抗增液的使用，阻斷G因子反應(yīng)，防止假陽性；

5.其它方法如過濾法、溶劑抽提等第三十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日十三、檢品的日常檢查

1.經(jīng)過干擾試驗的驗證后，則可進行檢品的日常內(nèi)毒素檢查，檢查法的反應(yīng)管按以下設(shè)置：

注：A為供試品溶液；B供試品陽性對照(PPC)；C為陽性對照(PC)；D為陰性對照(NC)