第八章目的基因的表達(dá)詳解演示文稿

第八章目的基因的表達(dá)詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共165頁。優(yōu)選第八章目的基因的表達(dá)當(dāng)前2頁，總共165頁。遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）。一、基因表達(dá)：當(dāng)前3頁，總共165頁。二、克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。當(dāng)前4頁，總共165頁。用原核生物作宿主AdividingE.coli第一節(jié)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子當(dāng)前5頁，總共165頁。識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有的RNA合成。數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達(dá)的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達(dá)的特點2.以操縱子為單位1.只有一種RNA聚合酶當(dāng)前6頁，總共165頁。5’3’轉(zhuǎn)錄mRNA5’3’翻譯蛋白質(zhì)NC5’3’3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。當(dāng)前7頁，總共165頁。當(dāng)前8頁，總共165頁。4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SrRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點Shine-Dalgarno（S-D）sequence:當(dāng)前9頁，總共165頁。二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項!外源基因不能帶有內(nèi)含子。2.必須用cDNA3.不能直接用真核基因組DNA。4.必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動子等）5.防止外源基因產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害。當(dāng)前10頁，總共165頁。是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控1.啟動子-35Box和-10Box（1）啟動子序列當(dāng)前11頁，總共165頁。consensussequences當(dāng)前12頁，總共165頁。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點17bp5’核糖體結(jié)合位點RNA聚合酶亞基的識別位點。①-35box當(dāng)前13頁，總共165頁。原核啟動子共有序列的功能當(dāng)前14頁，總共165頁。（2）翻譯的起始位點①核糖體結(jié)合位點（RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯當(dāng)前15頁，總共165頁。AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密碼：當(dāng)前16頁，總共165頁。2.轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。在表達(dá)載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子當(dāng)前17頁，總共165頁。由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互作①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U當(dāng)前18頁，總共165頁。5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊↓mRNA折疊UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脫落當(dāng)前19頁，總共165頁。當(dāng)前20頁，總共165頁。大腸桿菌偏愛UAA。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。4.翻譯增強子Translationenhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段。213.翻譯終止密碼當(dāng)前21頁，總共165頁。①必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。②應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。（1）最佳啟動子必須具備的條件5.基因工程常用的原核啟動子p87當(dāng)前22頁，總共165頁。來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當(dāng)誘導(dǎo)物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。PlacO目的基因（2）乳糖啟動子lac當(dāng)前23頁，總共165頁。（3）色氨酸啟動子trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；O操縱基因；衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。當(dāng)前24頁，總共165頁。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶鏈鏈分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄（P1是主要啟動子，P2的作用只有3%。）沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。當(dāng)前25頁，總共165頁。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸結(jié)合不轉(zhuǎn)錄用于表達(dá)載體的trp啟動子一般只包含啟動基因、操縱基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸時，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄（稱為corepressor）。當(dāng)前26頁，總共165頁。當(dāng)前27頁，總共165頁。當(dāng)前28頁，總共165頁。四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（1）包涵體（inclusionbody）P93是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知。當(dāng)前29頁，總共165頁。在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。②缺點①優(yōu)點當(dāng)前30頁，總共165頁。2.周質(zhì)中表達(dá)（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復(fù)雜機理目前不完全清楚優(yōu)點：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。當(dāng)前31頁，總共165頁。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等（3）常用的原核信號肽①大腸桿菌的信號肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。（2）信號肽（signalpeptide）當(dāng)前32頁，總共165頁。鼠源RNase、人生長激素信號肽。也能在細(xì)菌中起作用。（2）真核信號肽④胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。②金黃色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。當(dāng)前33頁，總共165頁。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。3.胞外表達(dá)或與細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達(dá)。當(dāng)前34頁，總共165頁。當(dāng)前35頁，總共165頁。載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點五、幾種類型的原核表達(dá)載體1.非融合型表達(dá)載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。當(dāng)前36頁，總共165頁。哈佛大學(xué)的Gilbert實驗室建立的。表達(dá)能力強。（1）pKK223-3載體P87組成結(jié)構(gòu)：①強啟動子:tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lac操縱基因②操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。當(dāng)前37頁，總共165頁。④終止子：③調(diào)節(jié)基因：LacI宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。如JM105菌。rrnB的強終止子rrnB強終止子S-D插入位點區(qū)⑤S-D序列和插入位點區(qū)：當(dāng)前38頁，總共165頁。tacPLacOS-D插入位點區(qū)rrnBT宿主lacI⑥載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。⑦表達(dá)誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）阻遏物IPTG當(dāng)前39頁，總共165頁。必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌。條件：當(dāng)前40頁，總共165頁。載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：pINIII系列：2.分泌型表達(dá)載體P92pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)當(dāng)前41頁，總共165頁。IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位點Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。②調(diào)節(jié)基因：lacI③S-D序列和起始密碼ATG。④分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位點區(qū)（多克隆位點）。①強啟動子：當(dāng)前42頁，總共165頁。pINIII-comA1以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的lacI.當(dāng)前43頁，總共165頁。表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。①啟動子：tac②操縱基因：lacP③調(diào)節(jié)基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)----pGEX系列P90（1）優(yōu)點（2）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。22當(dāng)前44頁，總共165頁。lacItaclacOS-D/ATGGST插入位點TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。（3）產(chǎn)物提純當(dāng)前45頁，總共165頁。（4）產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用當(dāng)前46頁，總共165頁。pGEX插入?yún)^(qū)：pGEX-1TCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATCGTGACTGACTGACGALeuValProArgGlySerProGluPheIleValThrAspEcoRIBamHI凝血酶當(dāng)前47頁，總共165頁。

CTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACGLeuValProArgGlySerProGlyIleHisArgAspEcoRIBamHI凝血酶ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACIleGiuGlyArgGlyIleProGlyAsnSerSerEcoRIBamHIXa因子pGEX-2X的插入?yún)^(qū)：pGEX-3X的插入?yún)^(qū)：SmaISmaI當(dāng)前48頁，總共165頁。（5）其他融合蛋白系統(tǒng)P91His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。當(dāng)前49頁，總共165頁。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）六、影響外源基因表達(dá)效率的因素1.啟動子的結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響RNA聚合酶σ亞基的識別位點（1）一致順序當(dāng)前50頁，總共165頁。（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強。5’-TTGACATATAAT一致順序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box當(dāng)前51頁，總共165頁。5’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4個堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.翻譯起始序列對表達(dá)效率的影響（1）S-D序列？？？？當(dāng)前52頁，總共165頁。AUG左側(cè)的三個堿基也有影響。（2）起始密碼AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。當(dāng)前53頁，總共165頁。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3-9個堿基。

在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。（3）其它當(dāng)前54頁，總共165頁。3.啟動子與外源基因之間的距離當(dāng)前55頁，總共165頁。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達(dá)。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達(dá)效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響但過度的外源基因的表達(dá)會影響宿主的正常生長。當(dāng)前56頁，總共165頁。選擇強啟動子序列，如tac等七、提高表達(dá)水平常用的方法2.調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。3.改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為3-9bp。能提高翻譯的起始效率。當(dāng)前57頁，總共165頁。4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5.減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。（1）誘導(dǎo)表達(dá)一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。去除轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異終止，加入抗終止的序列元件，加放正常轉(zhuǎn)錄終止序列。選用RNase缺失的受體菌當(dāng)前58頁，總共165頁。cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長。32°C:42°C:cI857阻遏物失活，PL啟動子啟動，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限制。cI857PL外源基因POPL啟動子是溫度誘導(dǎo)型當(dāng)前59頁，總共165頁。調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG:阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有IPTG:阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。tac啟動子是藥物誘導(dǎo)型當(dāng)前60頁，總共165頁。（2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。當(dāng)需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。當(dāng)前61頁，總共165頁。N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）設(shè)計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。質(zhì)?；虍a(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割6.提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。當(dāng)前62頁，總共165頁。①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶?？砂裵in增加到載體上。（2）使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。當(dāng)前63頁，總共165頁。（3）表達(dá)分泌蛋白細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。當(dāng)前64頁，總共165頁。細(xì)菌蛋白分泌的條件：位于N端，一般為15-30aa。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似,功能相似，可以互換。堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶外源蛋白

①有信號肽。當(dāng)前65頁，總共165頁。③細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制。真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)；但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號肽酶I、信號肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。②蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa序列。為蛋白指明目的地。當(dāng)前66頁，總共165頁。九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1.形成正確的二硫鍵當(dāng)前67頁，總共165頁。人胰島素分子當(dāng)前68頁，總共165頁?？贵w分子人血紅蛋白分子當(dāng)前69頁，總共165頁。如信號肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。2.前體切割當(dāng)前70頁，總共165頁。（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。3.蛋白質(zhì)糖基化糖基當(dāng)前71頁，總共165頁。（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖當(dāng)前72頁，總共165頁。磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化4.氨基酸殘基的修飾羥脯氨酸甲基組氨酸羥賴氨酸羧基谷氨酸當(dāng)前73頁，總共165頁。缺乏蛋白質(zhì)的加工。（如糖基化、氨基酸修飾等）。十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷當(dāng)前74頁，總共165頁。酵母菌、植物原生質(zhì)體、動物培養(yǎng)細(xì)胞等。第二節(jié)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)真核或病毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因當(dāng)前75頁，總共165頁。①能在E.coli中克隆和擴增。1.酵母克隆載體一、在酵母中表達(dá)P275Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合適的克隆位點。③有酵母的選擇標(biāo)記Ori②有大腸桿菌的選擇標(biāo)記Ampr、Tetr。當(dāng)前76頁，總共165頁。DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells當(dāng)前77頁，總共165頁。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷（選擇標(biāo)記）構(gòu)成。ColE1酵母Leu2+如PYeleu10:（1）整合型載體(YIp)當(dāng)前78頁，總共165頁。①轉(zhuǎn)化率低（1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA）。特點：載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒有酵母的自主復(fù)制區(qū)?？膳c受體細(xì)胞的染色體DNA同源重組，隨染色體一起復(fù)制。②不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制③整合到酵母的染色體上④不能從酵母細(xì)胞中提取載體。當(dāng)前79頁，總共165頁。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷(選擇標(biāo)記和酵母DNA自主復(fù)制順序ARS）構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒酵母ARS（2）復(fù)制型載體(YRp)酵母選擇標(biāo)記當(dāng)前80頁，總共165頁。ARSARS（automouslyreplicatingsequence）:ATTTTATATTTATGT250bp保守區(qū)當(dāng)前81頁，總共165頁。特點：①轉(zhuǎn)化率高（102-103轉(zhuǎn)化子/微克DNA)。④不穩(wěn)定，容易丟失。②可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制。③穿梭載體（shuttlevector）當(dāng)前82頁，總共165頁。在YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的著絲粒區(qū)。特點：YRp質(zhì)粒酵母著絲粒（3）著絲粒質(zhì)粒(YCp)③不易從細(xì)胞中提取。①行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。②單拷貝存在。當(dāng)前83頁，總共165頁。由大腸桿菌質(zhì)粒、2m質(zhì)粒及酵母染色體DNA選擇標(biāo)記構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒酵母選擇標(biāo)記2m質(zhì)粒如pYF92:pBR3222m酵母his3+（4）附加體型載體(YEp)當(dāng)前84頁，總共165頁。2m質(zhì)粒：釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是2m。含有自主復(fù)制起始區(qū)ori和STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。當(dāng)前85頁，總共165頁。特點：①很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA）.②拷貝數(shù)多（25-100分子/細(xì)胞）。③比YRp穩(wěn)定。當(dāng)前86頁，總共165頁。YEp24當(dāng)前87頁，總共165頁。Leu-

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG整合到染色體上，或獨立在酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長酵母載體大腸桿菌提取插入外源基因鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物分離、純化2.酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程當(dāng)前88頁，總共165頁。（1）優(yōu)點①對其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。②小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長。③已經(jīng)分離出很強的啟動子。④有翻譯后的加工。⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純化。⑥安全性高（FDA確認(rèn)的安全生物），不需要宿主的安全性檢驗。3.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點當(dāng)前89頁，總共165頁。②常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。③重組蛋白常常超糖基化①表達(dá)量普遍低。（2）缺點每個N-寡糖鏈上含有100多個甘露糖，④分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-13個甘露糖。分泌型蛋白有時會留在壁膜間隙，當(dāng)前90頁，總共165頁。4.在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白當(dāng)前91頁，總共165頁。24當(dāng)前92頁，總共165頁。（1）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表達(dá)：5.在啤酒酵母中表達(dá)外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O過氧化物酶表達(dá)出的SOD修飾正確：起始氨基酸被切掉，第二個氨基酸丙氨酸也被乙?；?。SOD(超氧化物歧化酶)當(dāng)前93頁，總共165頁。宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脫氫酶當(dāng)前94頁，總共165頁。（2）表達(dá)分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：構(gòu)建載體在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子a1的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的N端通過Lys-Arg相連。前導(dǎo)肽（leaderpeptide）：當(dāng)前95頁，總共165頁。蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶識別這個切點信號，把重組蛋白正確切下來。信號肽的切割：前導(dǎo)肽Lys-Arg重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶當(dāng)前96頁，總共165頁。6.其它酵母表達(dá)系統(tǒng)（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達(dá)在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇時，表達(dá)的乙醇氧化酶高達(dá)胞內(nèi)總蛋白的40%！①嗜甲烷酵母（Pichiapastoris）的特點當(dāng)前97頁，總共165頁。HBsAg:乙肝表面抗原?？梢宰鳛橐呙纭ox1：乙醇氧化酶基因1啟動子（受甲醇激活調(diào)控）。His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。3’-aox1：整合到特定染色體的位點序列。②表達(dá)載體構(gòu)建（整合型）：誘導(dǎo)物：甲醇。產(chǎn)量：9×106劑疫苗/240L發(fā)酵罐。當(dāng)前98頁，總共165頁。整合到染色體中當(dāng)前99頁，總共165頁。（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表達(dá)作為飼料添加劑促進反芻動物消化。產(chǎn)量：10L，200h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出50g溶菌酶。當(dāng)前100頁，總共165頁。二、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1.桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物。（1）侵染周期：兩種形式①單獨病毒粒子形式病毒粒子宿主細(xì)胞病毒粒子侵染釋放當(dāng)前101頁，總共165頁。病毒粒子宿主細(xì)胞侵染宿主細(xì)胞侵染合成多角體蛋白裂解釋放多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細(xì)胞核型多角體病毒（Autographacaliforniamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）②多面體形式當(dāng)前102頁，總共165頁。（2）桿狀病毒的表達(dá)特點①感染后36-48h，病毒開始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的啟動子特別強。③多角蛋白基因可以被替換掉而不影響病毒的繁殖。當(dāng)前103頁，總共165頁。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。3.轉(zhuǎn)化子篩選通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細(xì)胞株，在這種細(xì)胞中，多角蛋白的啟動子特別活躍。2.最普遍應(yīng)用的宿主細(xì)胞株當(dāng)前104頁，總共165頁。（1）轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。4.桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀DNA），不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動子和終止子及polyA加尾信號。啟動子與終止子之間插入多克隆位點當(dāng)前105頁，總共165頁。轉(zhuǎn)移載體當(dāng)前106頁，總共165頁。（2）桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化過程①轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因②轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPVDNA共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞③轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換④外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中⑤重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重組蛋白。當(dāng)前107頁，總共165頁。當(dāng)前108頁，總共165頁。4.目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白當(dāng)前109頁，總共165頁。5.桿狀病毒大規(guī)模表達(dá)存在的問題桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達(dá)外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠”。22只粉蚊夜蛾幼蟲4天后表達(dá)的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲總蛋白的2%-5%。共產(chǎn)出9mg很純的產(chǎn)物。（1）壽命短感染4-5天后宿主細(xì)胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低重組率更低。0.1%-1%。當(dāng)前110頁，總共165頁。三、外源基因在植物中表達(dá)根瘤存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti質(zhì)粒:當(dāng)前111頁，總共165頁。Tiplasmid當(dāng)前112頁，總共165頁。環(huán)狀雙鏈DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相當(dāng)于細(xì)菌染色體的3%-5%）。（1）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)當(dāng)前113頁，總共165頁。轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機整合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。左邊界右邊界生長素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成①T-DNA（transfer-DNA）生長素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）編碼合成吲哚乙酸（植物生長激素）的酶iaaM:色氨酸-2-單加氧酶當(dāng)前114頁，總共165頁。色氨酸-2-單加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸細(xì)胞分裂素基因tmr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶,催化：二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單磷酸（IPA）5’-AMP當(dāng)前115頁，總共165頁。章魚堿（octopine)胭脂堿（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成Arg與酮戊二醛縮合成冠癭堿（opine）的類型和化學(xué)結(jié)構(gòu)當(dāng)前116頁，總共165頁。農(nóng)桿堿（agropine）冠癭堿（opine）的作用冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。Glu的二環(huán)糖衍生物。當(dāng)前117頁，總共165頁。②毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移，進入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIRD2蛋白結(jié)合，并在VIRD4和VIRB蛋白的幫助下穿過濃桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的5’端是右邊界區(qū)域，含有25bp重復(fù)序列，參與整合。當(dāng)前118頁，總共165頁。章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因：③冠癭堿代謝基因分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。當(dāng)前119頁，總共165頁。（1）第一步:植物受傷植物受傷后能分泌酚類化合物（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。2.農(nóng)桿菌的感染和生存當(dāng)前120頁，總共165頁。（1）第二步感染植物（3）第三步毒性基因（vir）表達(dá)T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細(xì)胞分裂素，形成植物冠癭瘤。膿桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步T-DNA轉(zhuǎn)移T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來，并運送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步誘導(dǎo)冠癭瘤當(dāng)前121頁，總共165頁。當(dāng)前122頁，總共165頁。（6）第六步土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。當(dāng)前123頁，總共165頁。3.Ti質(zhì)粒的種類根據(jù)所編碼的冠癭堿（opine），分為（1）章魚堿（octopine)型質(zhì)粒當(dāng)前124頁，總共165頁。（3）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒（2）胭脂堿（nopaline）型質(zhì)粒當(dāng)前125頁，總共165頁。裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉植物（玉米）。（1）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。（2）能轉(zhuǎn)化多種植物。（3）強啟動子4.Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對象5.Ti質(zhì)粒作為載體的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達(dá)。25當(dāng)前126頁，總共165頁。（1）分子量太大（120kb）?。?）限制性酶切位點太多。（3）被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞成為腫瘤，不能再分化。（4）在大腸桿菌中不能復(fù)制。6.天然Ti質(zhì)粒作載體的缺點當(dāng)前127頁，總共165頁。（4）冠癭堿合成對于植物無意義。應(yīng)剔除掉。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇標(biāo)記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號和結(jié)束信號以及添加polyA的信號序列。（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因，左右邊界）。（2）減少限制性酶切位點，引入單一插入位點。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不再成為腫瘤，能正常分化。7.Ti質(zhì)粒的改造當(dāng)前128頁，總共165頁。改造后的Ti質(zhì)粒載體模式leftrightMCSAMProriVirselect當(dāng)前129頁，總共165頁。8.Ti載體的類型（1）共整合載體（cointegratevectors）最早獲得廣泛應(yīng)用的Ti質(zhì)粒是比利時科學(xué)家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重組才能插入外源基因。①pGV3850的特點：是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。當(dāng)前130頁，總共165頁。當(dāng)前131頁，總共165頁。宿主土壤農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記是位于中間載體pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。1）膿桿菌選擇標(biāo)記2）最終受體植物的選擇標(biāo)記②選擇標(biāo)記卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素對植物有劇毒！）當(dāng)前132頁，總共165頁。③外源基因插入pGV3850的過程當(dāng)前133頁，總共165頁。轉(zhuǎn)化后可誘導(dǎo)愈傷組織分化成轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)前134頁，總共165頁。（2）雙元載體（binaryvectors）既有大腸桿菌復(fù)制起點也有農(nóng)桿菌復(fù)制起點，是個穿梭載體。Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、vir基因。大幅度減小質(zhì)粒的體積。（<10kb）①雙元載體的結(jié)構(gòu)Ti的精髓：Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合）當(dāng)前135頁，總共165頁。當(dāng)前136頁，總共165頁。②雙元載體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右邊界）的“幫助質(zhì)?！碧峁﹙ir產(chǎn)物。1）基因插入2）幫助質(zhì)粒（helperplasmid）Vir產(chǎn)物使雙元載體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。當(dāng)前137頁，總共165頁。左右外源基因雙元載體Vir幫助質(zhì)粒農(nóng)桿菌Vir農(nóng)桿菌左右外源基因感染植物轉(zhuǎn)化左右外源基因進入植物細(xì)胞核，整合，表達(dá)E.coli當(dāng)前138頁，總共165頁。（3）三親融合法(triparentalmatig)含雙元載體的大腸桿菌：含有外源基因和左右邊界。含有幫助質(zhì)粒的輔助細(xì)菌：含vir基因。受體農(nóng)桿菌（空）：三種菌混合培養(yǎng)，然后通過各自的抗菌素抗性標(biāo)記選擇吸收了外源基因、左右界、和Vir的農(nóng)桿菌。三親當(dāng)前139頁，總共165頁。四、在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)1.動物細(xì)胞基因克隆和表達(dá)載體---SV40病毒常用的SV40載體，是從猿猴空泡病毒SV40（simianvacuolatingvirus40）改造而來的。當(dāng)前140頁，總共165頁。①20面體外殼：由VP1、VP2和VP3三種病毒外殼蛋白構(gòu)成。5243bp的環(huán)狀雙鏈。②DNA：（1）SV40病毒的結(jié)構(gòu)當(dāng)前141頁，總共165頁。SV40猿猴細(xì)胞細(xì)胞裂解釋放SV40嚙齒類細(xì)胞細(xì)胞癌變SV40DNA整合到寄主染色體上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式當(dāng)前142頁，總共165頁。T-抗原（tumorantigen）:兩個6聚體的T抗原結(jié)合在SV40DNA的復(fù)制起始點上，分別向相反方向移動，將雙鏈DNA解螺旋。隨后單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssB）與解開的單鏈DNA結(jié)合維持解旋狀態(tài)。(3)SV40DNA的復(fù)制①解鏈SV40編碼的蛋白。功能是在SV40DNA復(fù)制的時候解開DNA雙鏈。當(dāng)前143頁，總共165頁。當(dāng)前144頁，總共165頁。當(dāng)前145頁，總共165頁。T抗原SV40DNA雙鏈當(dāng)前146頁，總共165頁。②SV40復(fù)制起始位點5’-CTCACTACTTCTGGAATAGC3’-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原結(jié)合位點GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT

TATTTTTTTTAATCAG富含AT區(qū)4869當(dāng)前147頁，總共165頁。①早期表達(dá)區(qū)：(4)SV40病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼大T抗原（控制DNA復(fù)制）和小t抗原。②晚期表達(dá)區(qū)：在DNA復(fù)制一段時間后表達(dá)，產(chǎn)物是VP1、VP2和VP3三種外殼蛋白。當(dāng)前148