色譜基礎(chǔ)知識(shí)

色譜基礎(chǔ)知識(shí)第一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日一、色譜起源色譜法起源于20世紀(jì)初，1906年俄國(guó)植物學(xué)家米哈伊茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。由于這一實(shí)驗(yàn)將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為色譜法。第二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分第三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜的主要目的是對(duì)混合物中的目標(biāo)物分離和定量

色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)流動(dòng)相：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱第四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜優(yōu)點(diǎn)同時(shí)分析分離性能好靈敏度高（ppm-ppb微克-納克）進(jìn)樣量?。?-100μL）第五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜分類以流動(dòng)相狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)劃分類型。用氣體作為流動(dòng)相的色譜法稱為氣相色譜法GaschromatographyGC.用液體作為流動(dòng)相的色譜法稱為液相色譜法LiquidchromatographyLC.第六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLCVSGC液相色譜：適用于高沸點(diǎn)大分子強(qiáng)極性熱穩(wěn)定性差的化合物的分析，流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用氣相色譜：適用于沸點(diǎn)低，熱穩(wěn)定性好的中,小化合物的分析。流動(dòng)相只起到運(yùn)載樣品分子的作用第七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLCVSGC高效液相色譜法采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相及特殊規(guī)格填料固定相等，分離效能高，應(yīng)用范圍廣,如氨基酸蛋白質(zhì)生物堿維生素有機(jī)酸農(nóng)藥，都可用高效液相色譜法進(jìn)行分析氣相色譜法雖然也具有快速分離效率高用樣少等優(yōu)點(diǎn)，但它要求樣品必須能夠汽化，從而受到樣品的揮發(fā)性限制。第八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的分離類型正相色譜(NP-HPLC)反相色譜(RP-HPLC)反相離子對(duì)色譜(RPIC)離子交換色譜(IEC)空間排阻色譜(SEC)手性化合物分離模式(Chiralseparationmode)第九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜

化合物保留時(shí)間隨流動(dòng)相配比的變化 不同極性的化合物出峰順序第十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日反相HPLC色譜柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

反向色譜:反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。適用于能溶于水/有機(jī)混合物的中性或非離子化合物樣品

反向色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日正相HPLC色譜柱硅膠型

氰基型

氨基型

糖類分析二醇基型蛋白質(zhì)分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日正相色譜：固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能基團(tuán)，如（NH2，APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。適用于不溶于水/有機(jī)混合物的親脂類樣品使用的流動(dòng)相（極性相對(duì)比固定相低，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜柱基本性能參數(shù)硅膠純度填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度尺寸填料床的長(zhǎng)度和內(nèi)徑粒徑平均顆粒直徑，通常3-10μm孔徑顆粒的孔或者腔的平均尺寸，范圍80-100A封尾用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來(lái)第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜中常用的術(shù)語(yǔ)色譜圖組分從色譜柱流出并通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基線

正常情況下，僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)線時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線。峰高（h）峰最大值到峰底的距離峰寬（W）

峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所做切線與峰底相交兩點(diǎn)間的距離。峰高一半處的峰寬叫半高峰寬（W?h）死時(shí)間（t0）實(shí)際上就是流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱所需要的時(shí)間保留時(shí)間（tR）從進(jìn)樣開始到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間,稱為此組分的保留時(shí)間

調(diào)整保留時(shí)間(t'R)扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間

t'R=tR-t0

容量因子（k）k=t'R／t0k值越大，組分出柱越慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日柱效柱效簡(jiǎn)而言之就是色譜柱對(duì)色譜中物質(zhì)分離能力的大小。柱效越高，分離效果越好，峰形越好。色譜柱的柱效和填料、柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑均有關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)，填料越細(xì)密、柱長(zhǎng)徑比越大，柱效越高。柱校的衡量用理論塔板數(shù)來(lái)表示。

理論塔板數(shù)（n）n=5.54×(tR/W?h)2n=16×(tR/W)2理論塔板高度（H）H=L/nL:色譜柱長(zhǎng)第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日分離度（R)R=2（tR2-tR1）/（W1+W2)相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰寬總和一半的比值。R<1時(shí),兩峰有部分重疊R=1時(shí),分離程度可達(dá)98%R=1.5時(shí),分離程度達(dá)99.7%，可認(rèn)為兩組分完全分離增加柱長(zhǎng)可以提高分離度，但延長(zhǎng)了分析時(shí)間第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日拖尾因子（T）T=W0.05/2d0.05W0.05W0.055%峰高處峰寬D0.055%峰高處的前半峰寬中國(guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95～1.05。T<0.95為前延峰，T>1.05為拖尾峰。

第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜圖的峰位置用于定性，色譜峰的峰高和峰面積用于定量，峰位置和峰寬用于色譜柱分離性能的評(píng)價(jià)和色譜條件的優(yōu)劣。第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日流動(dòng)相流動(dòng)相選擇注意事項(xiàng)：純度：采用“

HPLC

”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日溶劑等級(jí)水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長(zhǎng)(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日HPLC用水可以通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)得到：1專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的純水機(jī)；5市場(chǎng)上瓶裝的純凈水或蒸餾水；6其它途徑；第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)越高放置時(shí)間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過(guò)0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無(wú)機(jī)離子及空氣等。第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日溶劑前處理

過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液。第二十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日溶劑前處理

脫氣

目的：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個(gè)溶劑所能容納的空氣總量要小氣泡對(duì)測(cè)定的影響：

1）柱壓波動(dòng)，流量偏小

2）基線波動(dòng)

返回第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑第三十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器B泵AB時(shí)間B

濃度第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日分析時(shí)間長(zhǎng)分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脫第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日95%30%MeOH濃度梯度洗脫第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日混合器低壓梯度比例閥高壓梯度低壓梯度脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日返回高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜(需兩臺(tái)或三臺(tái)泵)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單需在線脫氣機(jī)存在時(shí)間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第三十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日泵的保養(yǎng)使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀；

避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；第三十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日色譜柱1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動(dòng)相PH使用范圍為2～7.5返回ODS柱的使用注意點(diǎn)：第三十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日柱的保養(yǎng)：柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)