質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座

質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第1頁(yè)目鞏固質(zhì)粒概念，經(jīng)過(guò)原理部分學(xué)習(xí)加深對(duì)質(zhì)粒DNA與染色體DNA理化性質(zhì)差異認(rèn)識(shí)學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA方法掌握酶切反應(yīng)操作質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第2頁(yè)質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第3頁(yè)質(zhì)粒是染色體外小型（1-200kb）共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳遺傳因子。是進(jìn)行DNA重組慣用載體。經(jīng)常編碼一些對(duì)宿主有利酶基因，這些基因表型主要為抗生素抗性。質(zhì)粒

質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第4頁(yè)

Ampr抗性基因Ampr抗性基因編碼一個(gè)周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mpβ-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第5頁(yè)常用質(zhì)粒提取方法煮沸法對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。提取質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA。堿裂解法質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第6頁(yè)堿裂解法提取原理

宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)狀態(tài)差異

加入堿變性時(shí)，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞自然狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)（酸中和），質(zhì)粒DNA快速準(zhǔn)確配置重新形成完全天然超螺旋分子。因?yàn)椴僮髟?，提取質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)超螺旋。質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第7頁(yè)①收菌②重懸③裂解④中和⑤過(guò)柱⑥洗滌⑦洗脫質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟

P1:50

mM葡萄糖

，25

mM

Tris-HCl,10

mMEDTApH

8.0

P2:0.2

M

NaOH,1%

SDSP3:3

M

醋酸鉀,2

M

醋酸

硅基質(zhì)膜在高鹽低pH值（pH≤7.5）時(shí)可結(jié)合DNA，在低鹽及高pH值（pH≥8）條件下洗脫。75%乙醇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第8頁(yè)取菌液12,000rpm離心2min

棄上清（盡可能吸盡上清）用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮加入250uLP2，溫和地上下顛倒6-10次(溶液粘稠清亮)加入350uLN3,馬上溫和上下翻轉(zhuǎn)6-10次（白色絮狀沉淀）12,000rpm離心10min小心吸收上清，加入吸附柱12,000rpm離心1min棄濾液加入700uLbufferPW12,000rpm離心1min，棄濾液空柱12,000rpm離心2min，室溫開(kāi)蓋放置3–5min加入500uLbufferPW12,000rpm離心1min，棄濾液吸附柱置于新離心管中，加入50-100uLbufferEB,室溫放置2min，12,000rpm離心1min，搜集質(zhì)粒溶液到離心管，-20℃保留。CWBIO質(zhì)粒提取和限制性內(nèi)切酶消化專家講座第9頁(yè)取菌液12,000rpm離心2min

棄上清（盡可能吸盡上清）用250uLPI重懸菌體沉淀，漩渦振蕩至徹底懸浮加入250uLP2，溫和地上下顛倒6-10次(溶液粘稠清亮)加入350uLP3,馬上溫和上下翻轉(zhuǎn)6-10次（白色絮狀沉淀）12,000rpm離心10min小心吸收裂解上清，加入吸附柱12,000rpm離心1min棄濾液加入500uLbufferPD12,000rpm離心1min，棄濾液空柱12,000rpm離心2min，室溫開(kāi)蓋放置3–5min加入600uLbufferPW12,000rpm離心1min，棄濾液（重復(fù)一次）吸附柱置于新離心管中，加入50-100uL洗脫液EB,室溫放置2min，12,000rpm離心1min，搜集質(zhì)粒溶液到離心管，-20℃保留。T&G（500uL平衡液BL，加入吸附柱12,000r