質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳

質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗目的掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理和方法。第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗原理DNA分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。在pH值為8.0～8.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗器材和試劑實驗器材：制膠模具，水平式電泳槽，電泳儀，微量移液器,微波爐,紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。樣品：

DNA分子量標準品，質(zhì)粒試劑瓊脂糖1×電泳緩沖液（TBE）6×上樣緩沖液溴化乙錠(EB)：10mg/ml

第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin）:含硫酸根和羧基的強酸性多糖，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象。瓊脂第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(1)操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外監(jiān)測及定量分析。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日缺點：1.機械強度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。

第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大小：實驗證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日上樣緩沖液

0.25％溴酚蘭；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液作用：①增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)②在電泳中形成肉眼可見的指

示帶，可預測核酸電泳的速度和位置③使樣品呈色，使加樣操作更方便第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日膠濃度（%）溴酚藍二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb電泳指示劑：

核酸電泳常用的指示劑有兩種溴酚藍（

bromophenolblue,Bb）；二甲苯青（

xylenecyanol,Xc），它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢。

第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日核酸電泳的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠銀染色第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15minEB染料有許多優(yōu)點，如染色操作簡便、快速，靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出。注意：EB被認為是一種強致癌物質(zhì)，操作時應盡量小心，配置和使用EB時都應帶上手套，且注意不要把EB灑到桌面或地板上。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日銀染色銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日實驗操作第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日操作步驟1.準備用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日2.配制1%瓊脂糖凝膠及倒膠具體步驟：三角瓶內(nèi)：1g瓊脂糖+100ml(1×TBE)煮膠溶解冷卻至60℃(不燙手)加EB倒板室溫下充分凝固垂直向上拔出梳子將膠板放入電泳槽向電泳槽中加入1xTBE緩沖液至剛沒過凝膠表面。第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日3.加樣將DNA樣品（5ul）與6×上樣緩沖液（1ul）混勻后，用微量加樣槍小心加入樣品孔內(nèi)。注意加樣槍的槍頭不可插入過深，以免刺穿凝膠，導致樣品外溢。每加完一個樣品要更換槍頭，以防止EB污染。

第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日4.電泳接通電源，一般紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日5.結(jié)果觀察電泳結(jié)束后，將凝膠板取出。在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，記錄實驗結(jié)果。第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日注意事項1、倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會使制板變形；2、膠一定要凝固好才能拔梳子，方