流式細胞儀分析課件

流式細胞儀分析

技術(shù)及應用2023/3/91檢驗本科流式細胞術(shù)（FCM）——是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。（圖1、2、3）2023/3/92檢驗本科第一節(jié)流式細胞儀的分析及

分選原理流式細胞儀由液流系統(tǒng)、光學與信號轉(zhuǎn)換測試系統(tǒng)和信號處理及放大的計算機系統(tǒng)三大基本結(jié)構(gòu)組成。流式細胞術(shù)所具有的分析和分選功能主要涉及光學原理、光電轉(zhuǎn)換原理和測試原理三部分。2023/3/93檢驗本科2、光學系統(tǒng)：由激光光源、分光鏡、光束成形器、透鏡組和光電倍增管組成。⑴激光光源：多為氣冷式氬離子激光器，其激光束波長為488nm，15mW。⑵分色反光鏡：反射較長波長的光，通過較短波長的光。⑶光束成形器：將激光器發(fā)射的激光束聚焦成高15μm、寬57μm的橢圓光斑。2023/3/95檢驗本科⑷透鏡組：將激光和熒光變成平行光，同時除去離散的室內(nèi)光。⑸濾片：長通濾片一允許長于設(shè)定波長的光通過；短通濾片一允許短于設(shè)定波長的光通過；帶通濾片一允許一定帶寬波長的光通過，其他波長的光不能通過。⑹光電倍增管：檢測熒光和散射光，同時將光學信號轉(zhuǎn)換成電脈沖（數(shù)字數(shù)據(jù)）信號。（圖13）2023/3/96檢驗本科3、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：主要由計算機及其軟件組成。2023/3/97檢驗本科被接收的光電信號被光電倍增管轉(zhuǎn)換成電壓脈沖和積分脈沖，使信號放大，該信號進入計算機系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、儲存、分析、處理，按不同的檢測設(shè)計采用相應軟件程序?qū)Y(jié)果進行綜合分析，并以圖像和數(shù)據(jù)顯示于熒光屏上。流式細胞儀產(chǎn)生分析的電信號主要是光散射信號和熒光信號，流式細胞儀依據(jù)細胞流經(jīng)光照射區(qū)時電壓訊號的強弱來分析和分選細胞。（圖5）（圖10）2023/3/99檢驗本科二、散射光的測定

細胞對光的散射是細胞在未遭受任何破壞情況下固有的特性。2023/3/910檢驗本科㈠前向散射光（FS）由激光束前方的FS檢測器收集，F(xiàn)S信號的強弱與細胞的體積大小成正比，用于檢測細胞或其他粒子物質(zhì)的表面屬性。（圖11）

（圖6）2023/3/911檢驗本科三、熒光測量熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發(fā)后產(chǎn)生，每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長，激發(fā)后又會產(chǎn)生特定波長熒光和顏色，通過濾光片，將不同波長的散射光，熒光信號區(qū)分并送到不同的光電倍增管，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)換、放大、數(shù)字化處理，就可以在計算機上直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞百分率。2023/3/913檢驗本科

選擇不同的單克隆抗體及熒光染料就可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個不同特征。流式細胞儀的檢測原理中最重要的一點就是檢測熒光的特定發(fā)射波長。2023/3/914檢驗本科㈠光信號測量線性放大器用于測量信號強度變化范圍較少或代表生物學線性過程的信號。對數(shù)放大器用于測量信號強度變化范圍大且光譜信號較復雜的信號。（圖13）流式細胞儀中最常用于單抗標記的熒光染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。2023/3/915檢驗本科四、細胞分選原理

㈠基本原理當細胞懸液形成液流柱經(jīng)流動室，通過機械振動使液流柱斷裂成一連串均勻的液滴，當實驗設(shè)計中設(shè)定了被分選細胞的特性參數(shù)時，此類細胞在形成液滴時會被充電，使其帶有正電荷或負電荷，帶電荷的液滴在落入電極偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場，依所帶電荷是正或是負而發(fā)生向右或向左道偏轉(zhuǎn)，落人指定的收集器中，完成細胞分選的目的。（圖14）

（圖9）2023/3/917檢驗本科㈡技術(shù)要求1、分選速度：至少5000個/秒，與分選細胞在懸液中的含量有關(guān)。2、分選純度：除與儀器的精密度相關(guān)外，還與被分選細胞與其他細胞有無相互重疊相關(guān)。2023/3/918檢驗本科3、分選收獲率：指設(shè)定通過測量點的分選細胞與實際收獲的分選細胞之間的比率。與被分選細胞與其他細胞有無相互重疊相關(guān)，還與純度有關(guān)，純度↑→收獲率↓。4、分選得率：是指從一群體細胞懸液中分辨出的目的細胞總量，再經(jīng)分選后獲得的目的細胞實際比率。與分選速度相關(guān)，分選速度↑→分選得率↓。2023/3/919檢驗本科第三節(jié)流式細胞儀免疫

分析的技術(shù)要求

一、免疫檢測樣品制備制備單細胞懸液是最關(guān)鍵的第一步。㈠外周血淋巴細胞樣品的制備單個核細胞的分離制備，最常用單次密度梯度離心法2023/3/921檢驗本科㈡培養(yǎng)細胞的樣品制備㈢新鮮實體組織單細胞懸液的制備常用方法有機械法、酶處理法、化學試劑處理法和表面活性劑處理法。㈣單細胞懸液的保存1、深低溫保存法2、乙醇或甲醇保存法3、甲醛或多聚甲醛保存法2023/3/922檢驗本科二、免疫分析中常用的

熒光染料與標記染色

㈠常用的熒光染料熒光染料需具備條件：1、有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)；2、對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收；3、發(fā)射光波長與激發(fā)光波長之間有較大的波長差；4、不影響結(jié)合抗體自身的特異性。2023/3/923檢驗本科㈡免疫熒光標記熒光染料與細胞成分結(jié)合的方式：1、結(jié)構(gòu)親和式：以電力結(jié)合，為帶正電荷的熒光分子與帶負電荷的核酸分子磷酸基團相互吸引2、嵌入結(jié)合方式：光分子直接嵌入核酸堿基對中。3、共價鍵結(jié)合方式：細胞DNA鍵的連接之間以原子結(jié)合方式展開，熒光分子與其形成共價結(jié)合方式。2023/3/925檢驗本科4、熒光標記抗體特異性結(jié)合方式：熒光分子與單克隆抗體的F（ab）’2片段氨基發(fā)生化學反應而形成熒光標記基團。前三種染色方式常用于細胞內(nèi)成分的染色分析，第四種方式為流式免疫熒光分析所常用。⑴直接免疫熒光染色法⑵間接免疫熒光染色法⑶雙參數(shù)或多參數(shù)分析時熒光抗體的組合技術(shù)2023/3/926檢驗本科㈡細胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制1、溫度對熒光染色的影響2、PH對熒光發(fā)射強度的影響3、熒光染料濃度的控制4、固定劑對免疫熒光染色的影響2023/3/929檢驗本科㈢儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制1、光路與流路校正2、PMT校準3、絕對計數(shù)的校準2023/3/930檢驗本科㈣免疫檢測的質(zhì)量控制1、同型對照：為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組織來源不同，應選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調(diào)整及設(shè)置電流電壓，在此基礎(chǔ)上進行樣本檢測可使熒光標記單抗的信號保持特異性，如不用同型對照，結(jié)果的可靠性將受到影響。2023/3/931檢驗本科2、全程質(zhì)控質(zhì)控物Immuno-TrolCells是全血質(zhì)控的凍干品，將其復溶后與待檢標本一起標記、洗滌和檢測，所得結(jié)果如達標定靶值，提示本次實驗結(jié)果可靠。2023/3/932檢驗本科第四節(jié)流式細胞術(shù)在免疫學

檢查中的應用一、淋巴細胞及其亞群的分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥基因分析五、在AIDS病檢測中的分析六、自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析2023/3/933檢驗本科掌握：⑴流式細胞儀的工作原理；⑵流式細胞儀的技術(shù)要點熟悉：流式細胞術(shù)在免疫學檢查中的應用了解：流式細胞儀的數(shù)據(jù)顯示與分析2023/3/934檢驗本科圖1流式細胞儀2023/3/935檢驗本科圖2流式細胞儀2023/3/936檢驗本科圖3流式細胞儀2023/3/937檢驗本科圖4流式細胞流動池模擬圖前向散射光鞘液噴嘴側(cè)向熒光信號2023/3/938檢驗本科圖5FCM工作原理流程圖鞘液分光鏡紅色熒光綠色熒光90°散射光前向散射光激光器細胞收集管細胞懸液電荷環(huán)偏轉(zhuǎn)板廢液2023/3/939檢驗本科圖6前向散射光示意圖大顆粒小顆粒激光器激光器激光探測器2023/3/940檢驗本科復雜性顆粒簡單性顆粒側(cè)向散射光探測器激光器激光器圖7側(cè)向散射光示意圖2023/3/941檢驗本科圖84色熒光峰形線圖FITCRD1ECDPC5熒光波長（nm）熒光強度2023/3/942檢驗本科圖9細胞分選原理3、細胞分選2、細胞膜、胞質(zhì)、胞核著色1、細胞懸液4、細胞培養(yǎng)、研究噴嘴激光2023/3/943檢驗本科圖10流式細胞儀工作原理噴嘴壓電晶體分色反光鏡阻斷濾片偏轉(zhuǎn)板－＋廢液抽吸前向散射光檢測器激光器樣品鞘液液滴形成信號液滴充電信號F1PMTF2PMTF1F2散射2023/3/944檢驗本科圖11前向散射原理圖2023/3/945