微生物接種和培養(yǎng)技術(shù) （藥品生物檢定技術(shù)課件）

項(xiàng)目4微生物接種、分離培養(yǎng)技術(shù)教學(xué)培訓(xùn)課件接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

接種方法：斜面接種、穿刺接種等。選擇一種好的接種方法，對于微生物的分離、純化、增殖和鑒別等都很重要。

為了確保純種不被雜菌污染，在整個(gè)過程中，必須進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。概述主要內(nèi)容微生物接種技術(shù)一二微生物培養(yǎng)三學(xué)生實(shí)訓(xùn)四微生物分離純化方法一、微生物接種技術(shù)（一）接種工具1．接種環(huán)和接種針環(huán)或針金屬柄絕緣柄用于固體、液體培養(yǎng)基的接種用于半固體培養(yǎng)基的接種環(huán)（針）部分材質(zhì)為白金絲或鎳鉻絲（一）接種工具2．玻璃涂棒在固體培養(yǎng)基表面將菌液均勻涂布時(shí)。主要用于液體標(biāo)本的涂布接種。涂布棒是由直徑為2~3mm的玻璃棒彎曲成L形制成。（一）接種工具3．滴管或吸管用于液體接種（二）無菌操作無菌操作技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。目的：保證待測檢品不被環(huán)境中微生物污染；防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。接種環(huán)境（二）無菌操作接種室接種箱超凈工作臺接種場所必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理于接種之前打開接種室和超凈工作臺紫外燈消毒30min，同時(shí)打開風(fēng)機(jī)；接種時(shí)必須關(guān)閉紫外燈要點(diǎn)：防止污染，嚴(yán)格的無菌操作接種者的雙手要進(jìn)行消毒處理，一般用75%酒精或0.01%新潔爾滅擦洗整個(gè)操作過程都要靠近酒精燈火焰接種工具、管、瓶口接種前后要通過灼燒滅菌棉塞不得亂放，操作中只能夾在手上不能用嘴直接吸吹吸管。不能有跑、跳等力度大的動作，以免引起空氣大振動而增加染菌機(jī)會。（二）無菌操作（三）接種操作方法接種的基本程序常用接種方法液體培養(yǎng)基接種半固體培養(yǎng)基的接種斜面培養(yǎng)基接種法接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行無菌室、超凈工作臺使用前后需進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌（三）接種操作方法1、液體接種法將菌種接種到液體培養(yǎng)基（試管、三角瓶）中的方法。接種目的：細(xì)菌的增菌培養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)菌的生化反應(yīng)等。操作方法（三）接種操作方法液體接種法操作方法1、標(biāo)記2、灼燒接種環(huán)滅菌3、取塞，灼燒管口4、冷卻，取菌6、重?zé)芸?，蓋塞7、重?zé)臃N環(huán)5、接種2、半固體培養(yǎng)基法：此法用于厭氣性細(xì)菌接種、檢查細(xì)菌的運(yùn)動能力。（二）接種操作方法方法：用接種針沾取少許菌種，移入裝有固體或半固體培養(yǎng)基的試管中，自培養(yǎng)基中心垂直刺入到底，然后按原來的穿刺線將針慢慢拔出。3、斜面接種法把各種培養(yǎng)條件下的菌種，接入斜面上。最常用、最基本的技術(shù)之一。用于好氣性微生物的接種。（二）接種方法接種工具：接種環(huán)（1）標(biāo)記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名（2）點(diǎn)燃酒精燈。（3）接種：1）手持試管將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于兩管之間。斜面向上，盡量放平。2）旋松管塞3）接種環(huán)灼燒滅菌※斜面接種2、左手持斜面，旋松管塞1、標(biāo)記3、灼燒接種環(huán)※斜面接種4）拔管塞：用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)※斜面接種5）取菌:接種環(huán)冷卻，輕沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使接種環(huán)碰到管壁，取出后帶菌接種環(huán)不可通過火焰。5、冷卻，取菌※斜面接種6）接種:在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。從斜面培養(yǎng)基底部向上作“Z”形來回密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長特點(diǎn)?！泵娼臃N7)塞管塞：取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動時(shí)納入不潔空氣。8)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。7、重?zé)芸?，蓋塞8、重?zé)臃N環(huán)斜面接種示意圖斜面接種法及接種后菌落生長示意圖

接種后菌落生長示意圖菌苔(lawn)分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。稀釋涂布平板法、平板劃線法是分離與純化微生物的常規(guī)方法。二、微生物的分離純化1、平板劃線分離法目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌、活菌計(jì)數(shù)。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本。二、微生物的分離純化連續(xù)劃線分離法：最常使用的、最基本的方法，其中圖B常用于含菌量較少的標(biāo)本。分區(qū)劃線法示意圖分區(qū)劃線分離要點(diǎn)：僅第1次劃線需要取菌。其他每區(qū)劃線之前一定要把殘余的菌體燒掉；待接種環(huán)完全能卻后通過前1區(qū)劃線相隔的區(qū)域不要交叉接種環(huán)要在培養(yǎng)基表面劃線，不要空劃，也不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基整個(gè)過程要無菌操作分區(qū)劃線法示意圖

三段分區(qū)法四段分區(qū)法五段分區(qū)法培養(yǎng)后情況單菌落（clone)菌落（R型）菌苔(lawn)細(xì)菌的群體形態(tài)菌落（S型）cultureplate菌落(R型)2、傾注分離法：本法用于微生物限度檢查中細(xì)菌、霉菌的計(jì)數(shù)。3、涂布分離法：主要用于活菌計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)。1、取樣2、沾燃燒酒精3、灼燒4、涂布三、微生物培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法分類根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣分類固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法需氧培養(yǎng)法1、固體培養(yǎng)法是指將微生物接種在固體培養(yǎng)基表面，在適宜的條件下進(jìn)行生長的方法。例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)法是指將菌種接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，在適宜的條件下進(jìn)行生長的方法?？捎糜谠鼍?。例如淺層液體培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)。（一）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類1、需氧培養(yǎng)法（好氣培養(yǎng)）在培養(yǎng)過程中，需加入氧氣，否則不能良好生長。如大腸桿菌、金葡菌。方法：平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)2、厭氧培養(yǎng)法（厭氣培養(yǎng)）這類微生物在培養(yǎng)時(shí)不需要氧分子參與。如破傷風(fēng)桿菌、乳酸菌方法：深層液體培養(yǎng)；還可以用物理、化學(xué)方法、生物學(xué)方法創(chuàng)造無氧條件（二）根據(jù)根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣分類1234接種工具：接種針、接種環(huán)無菌操作：創(chuàng)造無菌環(huán)境，重視無菌操作接種方法：液體接種、穿刺接種、劃線接種等4微生物分離純化方法：劃線分離法、稀釋平板涂布法5微生物的培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)；好氧、厭氧培養(yǎng)學(xué)習(xí)小結(jié)（一）實(shí)訓(xùn)目的1．掌握無菌技術(shù)，樹立無菌觀念，能運(yùn)用無菌操作技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌的接種操作；2．掌握液體接種、半固體接種、斜面接種的操作方法；3、掌握采用平板劃線分離的方法；（二）材料和用具1.菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌。2.培養(yǎng)基：固體、半固體、液體培養(yǎng)基。3.儀器：酒精燈、接種環(huán)、接種針、試管架、酒精棉球、打火機(jī)、記號筆、超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱等。（三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、細(xì)菌液體接種：將試管中的菌懸液接種倒液體培養(yǎng)基2、細(xì)菌斜面接種：將菌種接種倒牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基3、倒平板：每人倒至少