真核生物基因表達調(diào)控

真核生物基因表達調(diào)控第一頁，共65頁。本章主要內(nèi)容基因表達與調(diào)控的基本概念與原理轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(transcriptionalregulation):DNAlevel(Genetic)Chromatinlevel(Epigenetic)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(post-transcriptionalregulation)：RNAinterference（RNAi）Proteindegradation（Ubiquitin/proteasome）第二頁，共65頁。第一節(jié)

基本概念與原理BasicConceptsandPrinciples第三頁，共65頁。Genome(cell’srepertoireofDNA)Transcriptome(cell’srepertoireofRNAtranscripts)Proteome(cell’srepertoireofproteins)單個基因單個細胞中心法則第四頁，共65頁。一、基因表達的概念基因組(genome)一個細胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因。基因表達(geneexpression)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子或RNA分子的過程?；虮磉_調(diào)控(generegulation,orregulationofgeneexpression)

基因表達是受內(nèi)源及外源信號調(diào)控的。第五頁，共65頁。RegulationofGeneExpressionChromatinepigeneticcontrolRNAsilencingProteindegradation一般而言的基因表達調(diào)控范疇第六頁，共65頁。二、基因表達的時間性及空間性（一）時間特異性按功能需要，某一特定基因的表達嚴(yán)格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporalspecificity)。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。第七頁，共65頁。人體發(fā)育過程中不同類型β-珠蛋白的含量變化

第八頁，共65頁。（二）空間特異性基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性(spatialspecificity)。第九頁，共65頁。BARD1isexpressedspecificallyintheapicaldomainsof

Arabidopsisinflorescence(A),ovules(B),anthers

(C),andembryos(D).InsuithybridizationA,B,C,D:antisenseBARD1probe;E:senseBARD1probeasanegativecontrol.（朱玉賢第五章課件）第十頁，共65頁。四種母源影響基因的mRNA和蛋白沿果蠅胚胎前-后軸分布的濃度變化圖

proteinBICOIDNANOS第十章（基因和發(fā)育）mRNA第十一頁，共65頁。FactsIdenticalgenome:VirtuallyeverycellinanorganismcontainsacompletesetofgenesSpatialspecificity:ButtheyarenotallturnedonineverycellortissueTemporalspecificity:EachcellofanorganismexpressesadistinctivesubsetofgenesatdifferenttimeordevelopmentalstageTight

regulation:Duringdevelopmentdifferentcellsexpressdifferentsetsofgenesinapreciselyregulatedfashion第十二頁，共65頁。三、基因表達的方式按對刺激的反應(yīng)性，基因表達的方式分為：（一）組成性表達(constitutiveexpression)某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(housekeepinggene)。第十三頁，共65頁。這類基因表達又稱為組成性基因表達(constitutivegeneexpression)。genesforessentialcellularstructuresandmetabolicpathways(e.g.rRNA,actin,tubulin)usuallyexpressedathighleveltheleveloftheirgeneexpressionmayvaryHousekeepinggenesrRNA,actin,tubulin

arecommonlyusedasloadingcontrolinRT-PCRorNorthernblot第十四頁，共65頁。（二）誘導(dǎo)和阻遏表達在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因(inducible

genes)。

如果基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答是被抑制，這種基因是可阻遏基因(repressiblegenes)?；虮磉_調(diào)控大多數(shù)是對這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯速率的調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物的水平發(fā)生改變，影響其功能。第十五頁，共65頁。四、基因表達調(diào)控的生物學(xué)意義（一）維持細胞增殖、分化（二）維持個體生長、發(fā)育（三）適應(yīng)環(huán)境變化第九、十章（基因與疾病、基因與發(fā)育）將要講到第十六頁，共65頁。1.Transcripts（轉(zhuǎn)錄本）beginandendbeyondthecodingregion(5’UTRand3’UTR)2.Theprimarytranscriptisprocessedby: 5’capping 3’formation/polyA

splicing3.Maturetranscriptsaretransportedtothecytoplasmfortranslation一般而言，基因表達調(diào)控主要是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)，即：mRNA合成的多少。transcription第十七頁，共65頁。五、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基本要素（一）RNA聚合酶(RNAPolymerase)（二）特異DNA序列(cis-actingelements)（三）調(diào)節(jié)蛋白(trans-actingfactors)GeneexpressionregulationatthelevelofDNA

(transcriptionalregulation) --highlysequence-dependent --variedregulationfordifferentgenes第十八頁，共65頁。cis-actingelements:promoters/regulatorysequencesofgenestrans-actingfactors:proteinsandRNAsthatbindcis-elementsandpromoteorrepressgeneexpression第十九頁，共65頁。

(一)RNA聚合酶啟動子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性。RNA

Pol

I:

rRNA,相對活性50-70%RNA

Pol

II:

mRNA,相對活性20-40%RNAPolIII:tRNA,相對活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相對活性??第二十頁，共65頁。真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達活性的特異DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelement)。

順式作用元件能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識別和結(jié)合，從而影響基因表達活性。啟動子(promoter)

順式作用元件又分增強子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA編碼序列轉(zhuǎn)錄起始點

（二）特異DNA序列第二十一頁，共65頁。反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或間接與順式作用元件相互作用，進而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子。按其功能不同，常有以下三類：

基本轉(zhuǎn)錄因子:識別promoter元件轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:識別enhancer或silencer共調(diào)節(jié)因子：不能進行DNA-蛋白質(zhì)相互作用（三）真核基因的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白第二十二頁，共65頁。RNA聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBP

associatedfactorsholoenzyme1.基本轉(zhuǎn)錄因子(generaltranscriptionfactor,GTF)

是指能夠直接或間接與啟動子核心序列TATA盒特異結(jié)合、并啟動轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF第二十三頁，共65頁。2.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(transcriptionfactor,TF)

這類調(diào)節(jié)蛋白能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點的上游序列和遠端的增強子元件，通過DNA－蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。決定不同基因的時間、空間特異性表達.

轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptionalactivator)

轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptionalrepressor)3.共調(diào)節(jié)因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白－蛋白相互作用，進而影響它們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,本身無DNA結(jié)合活性。如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用——共激活因子；與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用——共阻遏因子。第二十四頁，共65頁。常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域(domain)DNA結(jié)合域（DNA

binding

domain)BasicAA(K/R)rich,positivelycharged轉(zhuǎn)錄激活域(trans-activationdomain)TF蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域（dimerization,co-factors）

谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域第二十五頁，共65頁。ZincFingerbHLHbZIPHomeodomain1）TF最常見的DNA

bindingdomain第二十六頁，共65頁。(1)鋅指(zincfinger)常結(jié)合GC

boxCys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-HisC-terminal:α-helixbindingDNA第二十七頁，共65頁。(2)堿性亮氨酸拉鏈bZIP第二十八頁，共65頁。bHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)(3)堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH第二十九頁，共65頁。2）TF常見的trans-activationdomain第三十頁，共65頁。(Activationdomainisinterchangeable)第三十一頁，共65頁。InteractionAssaysDesignofTwo-hybrid/Three-hybrid/etc…separablefunctionaldomainsTwo-hybridassay(protein-protein)Tri-hybridassay(protein-RNA)第三十二頁，共65頁。

1.

RNA

polymerase

II

2.

promoter

and

enhancers

3.

transcription

factorsEukaryoticgeneexpressionisusuallycontrolledatthelevelofinitiationof

transcription.真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控第三十三頁，共65頁。

Holoenzyme---asupramolecularcomplexcomprisingPolII, mostGTFs,andMediator/SrbcomplexInyeast,a2MDaholoenzyme+TBPsufficesfortranscriptionOrderedAssemblyandPolIIHoloenzymeTFIIDTFIIDone-stepmultiple-step第三十四頁，共65頁。TFIIBbindstoDNAandcontactsRNA

polymeraseneartheRNAexitsiteandattheactivecenter,and

orientsitonDNA.+25bpQ:prok-10bpvseuk-25bp?SequentialAssemblyTBP:TATAbindingproteinTAFs:TBPassociatedfactorsBindingofTFIID(TBP+11TAFs,800KD)totheTATAboxisthefirststepininitiation.第三十五頁，共65頁。CTD：RNAPolIIC-terminaldomainCTDisanunusualextensionappendedtotheCterminusofthelargestsubunitofRNApolymeraseII.Itcomprisesfrom25to52tandemcopiesoftheconsensusrepeatheptadY1S2P3T4S5P6S7.S2andS5aremajorphosphorylationsites.CTDphosphorylationcausetheconversionofprolineisomerizationstates.PhosphorylationpatternsontheCTDrepeatsdeterminedifferentsetsofassociatedfactors,sothatprovideadynamicplatformtorecruitdifferentregulatorsofthetranscriptionapparatus.Ineukaryoticcells,thetranscriptionofgenesisaccuratelyorchestratedbothspatiallyandtemporallybytheC-terminaldomainofRNApolymeraseII(CTD).第三十六頁，共65頁。PIC:PhosphoS5isrequiredforassemblyofthePICandfacilitatesmRNAcappingviarecruitmentofcappingenzymes.Elongation:S5graduallybecomesdephosphorylated,whereasS2isphosphorylated.Terminating:PhosphoS2ensuresefficient3′-RNAprocessingbytriggeringrecruitmentof3′-RNAprocessingmachinery.Ending:CTDsarefreeofphosphategroups;non-phosphorylatedCTDsarerequiredforRNApolymeraseIItorecycleandbindapromoterforthenextcycleoftranscription.S2&S5,thetriggerfortranscriptionalprocessmodulation第三十七頁，共65頁。第三十八頁，共65頁。FactorsinvolvedingeneexpressionincludeRNA

polymeraseandthebasalapparatus,activatorsthatbinddirectly

to,co-activatorsthatbind

tobothactivatorsandthebasalapparatus,andregulatorsthat

actonchromatinstructure(chromatinremodelingcomplex).ManyTranscriptionalActivatorsi.e.CAATGC-box第三十九頁，共65頁。NeartheinitiationsiteAlittlefaraway第四十頁，共65頁。SP1stimulatestranscriptioninpresenceofTAFII110GCboxesboundbyDNAbindingproteinSP1SP1recruitsTFIIDbybindingTAFII110Partiallyreconstitutedcomplex(TBPand3TAFs)inadditionto otherGTFs,PolIIleadstohighlevelsoftranscription

SV40earlypromoterNear第四十一頁，共65頁。MediatorcomplexistargetedbyanactivatorMediatorisastablecomplexcontainingseveralproteins(20-50)MediatorbindstotheRNApolIIandtranscriptionfactors(activators orrepressors)and‘mediates’theregulatorysignalstopolII(中介復(fù)合體）Far第四十二頁，共65頁。Whatisthemechanismofactivation?Twomodels:

Tetheringholoenzyme

(recruitment)Activatingholoenzyme(allosteric)(interactionactivation)??第四十三頁，共65頁。Infavorofrecruitment

model（勾引模型）第四十四頁，共65頁。tatproteinofHIVcanstimulate

transcriptioninitiationwithoutbindingDNAatall

TheactivatingdomainofthetatproteincanstimulatetranscriptionifitistetheredinthevicinityofpromoterbybindingtotheRNAproduct(tarsequence)ofapreviousroundoftranscription.tartat第四十五頁，共65頁。DNA-bindingdomainistobringtheactivationdomainintothevicinityofthestartpoint.

Andactivationisindependentofthemeansoftethering.wecanthinkofDNA-binding(orRNA-bindinginthecaseoftat)domainasprovidinga"tethering"function,whosemainpurposeistoensurethattheactivationdomainisinthevicinityoftheinitiationcomplex.Thenotionoftetheringisamoregeneralideathatinitiationrequiresahighconcentrationoftranscriptionfactorsinthevicinityofthepromoter.Thismaybeachievedwhenactivatorsbindtoenhancers,upstreampromoterelements,orinanextremecasebytetheringtoanewly-madeRNAproduct.第四十六頁，共65頁。總結(jié)

所有激活因子的共性：識別靶位點（啟動子、增強子）的特異性由DNA結(jié)合域決定。DNA結(jié)合域?qū)⑥D(zhuǎn)錄激活域帶到基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域附近。

直接作用的激活因子具有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。

沒有轉(zhuǎn)錄激活域的激活因子可能與具有轉(zhuǎn)錄激活域的共激活因子一起行使功能。

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域中許多元件是（共）激活因子的靶位點RNA聚合酶可以和多種不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成全酶復(fù)合物行使功能。第四十七頁，共65頁。‘Synergy’

HighlevelsoftranscriptioninducedbymultiplefactorsTranscriptionfactorscanenhancetranscriptioninanon-linearmannerSynergisiticactivationoccursduetomultiplecontactswiththemachineryMultiplecopiesofthesameactivatoralsoinducesynergisticactivation第四十八頁，共65頁。Interferon?enhancerEnhancersoftenhavebindingsitesforseveraltranscription

factorsTranscriptionfactorscanbind

cooperativelyatadjacentsitesArchitecturalfactors(withnoregulatorydomains,i.e.HMG1)canassistassemblyRemarkablyincreasebindingaffinityforbothDNAandmachinery第四十九頁，共65頁。HMG1肩并肩、手挽手，根基穩(wěn)、魅力足香肩并立、玉指緊扣，腳如磐石、面若桃花第五十頁，共65頁。Onepossiblestrategy:----Looping----Cohesinshelptostabilizeenhancer-promoterinteractionsHowdoenhancersactindependentofdistanceandorientation?第五十一頁，共65頁。Anenhancermayfunctionbybringingproteinsintothevicinityof

thepromoter.Anenhancerdoesnotactonapromoterattheoppositeendofalong

linearDNA,butbecomeseffectivewhentheDNAisjoinedintoacirclebyaprotein

bridge.An

enhancerandpromoteronseparatecircularDNAsdonotinteract,butcan

interactwhenthetwomoleculesarecatenated.Twoexperimentssupporttheloopingmodel--Theessentialroleoftheenhanceris

toincreasetheconcentrationofactivatorin

thevicinityofthepromoter---第五十二頁，共65頁。Receptorsformanysteroidandthyroid

hormoneshaveasimilarorganization,withanindividualN-terminalregion,conservedDNA-bindingregion,anda

C-terminalhormone-bindingregionSteroidreceptorsaretranscriptionfactorsZinc

finger

TF第五十三頁，共65頁。Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheir

receptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionis

neededforpromoterfunction.ActivationofGlucocorticoidReceptor(GR)Nuclearshuttling第五十四頁，共65頁。利用GR的特性構(gòu)建可誘導(dǎo)表達融合蛋白系統(tǒng)DexamethasoneGRGRGRXXXDexamethasone（DEX）:地塞米松,氟美松(抗炎藥)，合成的一種糖皮質(zhì)激素；通過分子克隆的方法將GR和要研究的核蛋白X構(gòu)建成融合蛋白，轉(zhuǎn)基因到酵母、動物細胞或者植物中；不施加外源DEX時，融合蛋白與HSP90形成復(fù)合物，由于構(gòu)象和空間位阻等原因，融合蛋白存在于胞質(zhì)中，不能定位到細胞核；添加DEX時，DEX擴散入胞與GR相結(jié)合，融合蛋白改變構(gòu)象后核定位信號暴露，即可入核行使功能；用以研究核蛋白的功能（包括轉(zhuǎn)錄因子）。第五十五頁，共65頁。ActivationTaggingapproach

inplantsPlanttransformationmutantsscreeninglocateT-DNAinsertionsiteinArabidopsisgenome(how?)identifytherightgeneconferringmutantphenotype(how?)構(gòu)建T-DNA序列，其中包括4倍重復(fù)的CaMV的35S增強字序列，4×35S元件可以大大增強相鄰基因的轉(zhuǎn)錄；通過轉(zhuǎn)基因的方法將T-DNA片段整合到植物基因組中；植物基因組上與T-DNA插入位點相近的基因表達量增高，即得到這個基因gain-of-function的轉(zhuǎn)基因植物；第五十六頁，共65頁。XVE＝LexA的DNA結(jié)合域(X)＋VP16轉(zhuǎn)錄激活域(V)＋humanestrogenreceptor調(diào)控域(E)NPTII；轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記OLexA-46：LexA操縱子＋CaMV35S基本啟動子（而非增強子）

Achemical-inducibleactivationtaggingvectorpER16inplants

RB->LB:T-DNAfragment(可以插入到基因組中)其工作原理為：在G10-90啟動子控制下，XVE融合轉(zhuǎn)錄因子組成型表達；當(dāng)加入雌激素，雌激素和受體調(diào)控域（E）結(jié)合，導(dǎo)致XVE融合蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，并由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進