不同碳源的生物除磷效率及合成HAs結(jié)構(gòu)

不同碳源的生物除磷效率及合成PHAs結(jié)構(gòu)分析摘要由由于PHB的加工性能能欠佳，目前前對PHAs的合成研究究多集中在中中短鏈PHAs共聚共混物物上。針對食食品、發(fā)酵廠廠廢水含多種種可發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)的特征，分分別采用乙酸酸鈉、乙醇、葡葡萄糖、可溶溶性淀粉和谷谷氨酸鈉為唯唯一碳源，研研究了SBR反應(yīng)器中生生物除磷的能能力及合成PHAs的特性。這5種碳源在厭厭氧階段的磷磷釋放量分別別為10.12、1.63、7.88、2.44和5.00mg/L，在好氧階階段的吸磷量量分別為0.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/L，總吸磷效效率的次序?yàn)闉橐掖迹ㄒ宜崴幔?gt;葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸鈉。反反應(yīng)液堿性不不斷增加導(dǎo)致致乙酸鈉吸磷磷能力受破壞壞，4h好氧吸磷量量僅為0.64mg/L，較多的小小分子有機(jī)酸酸生成有利于于好氧吸磷能能力的提高。用GC-MS解析了這5種碳源合成PHAs的結(jié)構(gòu)，分別由乙酸鈉、乙醇和谷氨酸鈉為唯一碳源所合成的PHAs主要為PHB，以葡萄糖和可溶性淀粉所合成PHAs主要為PHBV，分析了不同碳源合成PHAs的代謝途徑，PHAs產(chǎn)物中琥珀酸的檢出證實(shí)了三羧酸循環(huán)參與了合成代謝。在谷氨酸鈉和可溶性淀粉合成產(chǎn)物中，混有菌體內(nèi)長鏈烷酸和烯酸如硬脂酸、軟脂酸和油酸。關(guān)鍵詞：碳源，除除磷，PHAs，結(jié)構(gòu)1前言PHAs（pooly-hyydroxyyalkannotes，聚羥基脂脂肪酸酯）是是活性污泥中中重要的碳源源儲存物質(zhì)，由由許多原核微微生物在不平平衡生長條件件下合成，擔(dān)擔(dān)當(dāng)生物除磷磷過程的能量量轉(zhuǎn)化作用。它它是一種性能能良好的高分分子聚合物，具具有完全可生生物降解性，是是替代化學(xué)合合成塑料消除除“白色污染”的理想新型型塑料，也是是醫(yī)療植入用用的理想可降降解性高分子子材料。該領(lǐng)領(lǐng)域的研究涉涉及環(huán)境科學(xué)學(xué)、生物化學(xué)學(xué)、分子生物物學(xué)和高分子子化學(xué)多個(gè)學(xué)學(xué)科。能產(chǎn)生PHAss的微生物種種屬有產(chǎn)堿桿桿菌屬、假單單胞菌屬、甲甲基營養(yǎng)菌、固固氮菌屬、紅紅螺菌屬和重重組大腸桿菌菌等[1]。在真真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌菌及多數(shù)微生生物中，合成成PHB（poly--3-hyddroxybbutyraate，聚3-羥基丁酸酯酯）的碳源有有糖類、有機(jī)機(jī)酸、乙醇和和二氧化碳等等多種含碳化化合物。PHB是PHAs中最常見且且被研究最多多的一種，但但它的結(jié)構(gòu)單單一規(guī)整，結(jié)結(jié)晶度高（65－80％），質(zhì)脆脆，抗沖擊強(qiáng)強(qiáng)度低，熔點(diǎn)點(diǎn)高（171－182℃），熔融狀狀態(tài)下易降解解為烯酸，加加工溫度區(qū)間間窄，混合菌菌種或混合碳碳源生成的PHAs共聚共混物物將會(huì)明顯改改善其加工性性能。食品、發(fā)發(fā)酵廠廢水含含有大量可發(fā)發(fā)酵碳源，本本研究以此類類廢水的代表表性成分如葡葡萄糖、乙酸酸鈉、乙醇、可可溶性淀粉及及谷氨酸鈉為為唯一碳源，探探討在厭氧/好氧釋磷吸吸磷過程的效效率，通過所所合成PHAs結(jié)構(gòu)分析，闡闡明不同碳源源合成PHAs的代謝途徑徑，為中長鏈鏈PHAs的生物合成成提供理論依依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)裝置、材材料及方法2.1實(shí)驗(yàn)裝置置自制SBR有機(jī)機(jī)玻璃反應(yīng)器器，圓柱狀部部分直徑14.5ccm，高20cm，錐底部分分高10cm，總有效體體積3.5L。砂芯曝氣氣頭從反應(yīng)器器下部供氣，由由中控器完成成厭氧/好氧、進(jìn)水/排水/排泥的狀態(tài)態(tài)切換，裝置置圖如圖1所示。1－反應(yīng)器主體體2－進(jìn)水閥3－出水閥4－排泥閥5－空氣閥6－氮?dú)忾y7－DO儀8－pH計(jì)9－水位計(jì)10－中控器圖1反應(yīng)裝裝置示意圖2.2實(shí)驗(yàn)材料料活性污泥：廣州州市獵德污水水處理廠；廢廢水：生活污污水、人工配配制廢水；化化學(xué)試劑：均均為市售分析析純。3-羥基丁酸酯PHB標(biāo)準(zhǔn)樣品：：購自ICI公司。人工工配制廢水主主要成分見表表1，5種主要碳源源分別按照800mgg/L的濃度加入入，其組成及及含量見表2。表1人工配配制廢水成分分（不含碳源源）成分乙酸銨KH2PO4MgSO4·77H2OFeSO4·77H2O濃度（mg/LL）5515.35105表25種碳碳源的含量成分葡萄糖乙酸鈉乙醇可溶性淀粉谷氨酸鈉濃度（mg/LL）7501040384687823污泥馴化方法：：加水，通氮氮?dú)?min，厭氧2h；開始曝氣氣，好氧4h，靜置30min后排去上清清液，補(bǔ)加生生活污水，循循環(huán)多個(gè)周期期，定期排泥泥。2.3分析方法法總磷（TP）：：硝酸-高氯酸法消消解，鉬銻抗抗分光光度法法；CODCr：重鉻酸酸鉀法；SS：重量法。[[2]PHAs色譜分分析樣品制備備：取適量污污泥凍干，將將定量污泥裝裝入螺紋封口口管中，加入入2ml含3％（v:v）濃硫酸的的甲醇及2g/L苯甲酸（作作為內(nèi)標(biāo)），加加入2ml氯仿后，蓋蓋緊蓋子，100℃水浴，酯化4h冷卻。加入2ml超純水，充充分混勻，離離心或室溫沉沉降30min以上，分層層，取下層有有機(jī)相作色譜譜分析[3]]。儀器條件：島津津GCMS--QP20110氣質(zhì)聯(lián)用，色色譜柱型號DB-1，30m×00.25mmm×0.255μm。升溫程序：1000℃保持2min后以10℃/min的速度升溫溫至200℃，接著以20℃/min升溫至250℃，保持1min。進(jìn)樣溫度度：260℃，GC-MS接口溫度為260℃，MS質(zhì)量掃描范范圍：20－550。3結(jié)果與討論3.1污泥的的馴化經(jīng)過2個(gè)月的馴馴化，污泥顏顏色由棕黑色色漸變?yōu)樽攸S黃色，MLSS保持在3000－6000mmg/L之間。污泥泥的沉降性能能有了顯著改改善，SVI＝47.5mml/g，好氧曝氣氣、靜置后的的上清液SS<100mg/L。3.2不同碳碳源的釋磷吸吸磷能力模擬食品、發(fā)酵酵廠的廢水，選選擇具代表性性的乙酸鈉、乙乙醇、葡萄糖糖、可溶性淀淀粉和谷氨酸酸鈉（味精）為為碳源，按照照初始COD約為800mgg/L配水，其余余成分同表1，將污泥平平分為5份分別接入入，經(jīng)過2h厭氧及4h好氧后的TP濃度變化見見圖2。圖2不同碳碳源在厭氧/好氧條件下下的TP濃度變化曲曲線將5種碳源在22h厭氧及4h好氧過程的TP濃度變化數(shù)數(shù)值列于表2中。對圖2及表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分分析，在厭氧氧階段，釋磷磷量由大到小小為乙酸鈉>葡萄糖>谷氨酸鈉>可溶性淀粉>乙醇；在好好氧階段，吸吸磷量由大到到小為葡萄糖糖>乙醇>谷氨酸鈉>可溶性淀粉>乙酸鈉。葡葡萄糖在厭氧氧過程釋放磷磷量為7.88mmg/L，稍低于乙乙酸鈉的10.122mg/L，但其好氧氧吸磷量卻是是最大為8.10mmg/L。從全過程程的絕對吸磷磷量計(jì)算，當(dāng)當(dāng)乙醇作為碳碳源時(shí)，厭氧氧階段釋磷最最少，有效吸吸磷量為6.00mmg/L。至于乙酸鈉在好好氧階段較少少吸磷的原因因，我們認(rèn)為為在配制人工工廢水時(shí)，采采用了乙酸的的鈉鹽來維持持反應(yīng)液的pH，當(dāng)乙酸根根作為碳源參參與了微生物物的代謝后，Na＋由此游離出出來，反應(yīng)液液的pH值不斷升高高至9－10，而微生物物吸磷的最佳佳pH值在5.5－6.5之間，過高高的pH值使吸磷能能力大大降低低。當(dāng)乙醇為為碳源時(shí)，在在厭氧條件下下很難被微生生物代謝，因因此厭氧釋磷磷最少，但在在好氧條件下下生成乙酸并并隨時(shí)被利用用，反應(yīng)液的的pH比較穩(wěn)定。因因此，以乙醇醇為碳源實(shí)際際上是乙酸在在反應(yīng)中起作作用?？扇苄孕缘矸蹫槠咸烟烟情L鏈，其其分子大小在在240－3800葡萄糖單位位范圍，必須須水解為葡萄萄糖后才能被被微生物吸收收利用。谷氨氨酸鈉帶有一一個(gè)-NH2，也要先經(jīng)經(jīng)過脫氨基才才能進(jìn)一步參參加代謝，因因此這兩種物物質(zhì)的代謝速速率比較慢。從從吸磷量大小小順序分析也也可得出較小小的分子有利利于吸磷且厭厭氧釋磷多好好氧吸磷也多多的結(jié)論。在在實(shí)際除磷工工藝中，要根根據(jù)不同來源源廢水的碳源源性質(zhì)，控制制厭氧/好氧反應(yīng)條條件以生成盡盡量多的小分分子有機(jī)物，力力求達(dá)到較高高的除磷效率率。表2不同碳碳源在厭氧/好氧條件下下的TP濃度變化單位：mg/L碳源種類乙酸鈉乙醇葡萄糖可溶性淀粉谷氨酸鈉初始TP5.776.776.406.456.77厭氧釋磷量ΔPP110.121.637.882.445.00好氧吸磷量ΔPP20.646.378.101.213.05*注：ΔP11＝第2h的瞬時(shí)總磷磷濃度－初始始總磷濃度ΔP2＝第2hh的瞬時(shí)總磷磷濃度－第6h的瞬時(shí)總磷磷濃度3.3不同碳碳源所合成PHAs的結(jié)構(gòu)及代代謝途徑分析析為實(shí)現(xiàn)污（廢）水水處理的資源源化目標(biāo)，將將好氧后的富富磷污泥排出出，進(jìn)行5種不同碳源源合成PHAs的實(shí)驗(yàn)，并并對產(chǎn)物進(jìn)行行GC-MS分析，以確確定其結(jié)構(gòu)。污污泥的培養(yǎng)采采用好氧6h，厭氧12h進(jìn)行，PHB標(biāo)準(zhǔn)樣品及5種碳源所合合成PHAs的GC-MS圖見圖3。圖3-aPPHBV標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖圖3-b以以乙酸鈉為碳碳源所合成PHAs的GC-MS圖圖3-c以以乙醇為碳源源所合成PHAs的GC-MS圖圖3-d以以葡萄糖為碳碳源所合成PHAs的GC-MS圖圖3-e以以可溶性淀粉粉為碳源所合合成PHAs的GC-MS圖圖3-f以以谷氨酸鈉為為碳源所合成成PHAs的GC-MS圖經(jīng)質(zhì)譜解析不同同保留時(shí)間所所對應(yīng)的物質(zhì)質(zhì)列于表3，可以看出出，由乙酸鈉鈉、乙醇為碳碳源所合成PHAs組分比較單單純，經(jīng)過6h好氧過程，乙乙醇經(jīng)氧化轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?，然然后它們通過過同樣的代謝謝途徑合成為為PHB：乙醇乙乙酸乙酰CoA乙酰乙酰CoA3--羥基丁酰CoAPHHB多糖作為微生物物營養(yǎng)時(shí)，必必須在微生物物細(xì)胞外被相相應(yīng)的酶水解解為單糖或雙雙糖，才能被被吸收和利用用。某些能利利用淀粉的微微生物可以向向胞外分泌淀淀粉酶，使淀淀粉水解成葡葡萄糖后才被被吸收入細(xì)胞胞內(nèi)進(jìn)一步降降解。因此，在在以可溶性淀淀粉為基質(zhì)的的PHAs合成過程中中，主要產(chǎn)物物與葡萄糖的的相同。乙酰CoA乙酰乙酰CoAD(--)3-羥基丁酰CoA淀粉葡萄萄糖丙酮酸PHBVV丙酰CoA丙酰乙酰CoAD(--)3-羥基戊酰CoA味精的主要成分分是谷氨酸鈉鈉，谷氨酸是是一種有代表表性的氨基酸酸，在動(dòng)、植植物、微生物物中普遍存在在的是L-谷氨酸脫氫氫酶，催化L-谷氨酸脫氫氫脫氨基，生生成α-酮戊二酸，這這些分解產(chǎn)物物可進(jìn)一步參參加代謝，進(jìn)進(jìn)入三羧酸循循環(huán)、轉(zhuǎn)變成成糖和脂肪或或合成新的氨氨基酸。Dioniisi[4]]等在以谷氨氨酸為唯一碳碳源合成PHAs的研究中，未未發(fā)現(xiàn)PHAs或糖原積累累現(xiàn)象，而本本研究從GC-MS圖譜中，可可以發(fā)現(xiàn)由谷谷氨酸鈉合成成了PHAs且為PHB，代謝途徑徑如下：琥珀酸谷氨酸α-酮戊二酸琥珀酰CoA乙酰乙酰CoAPHHB在所有合成PHHAs的產(chǎn)物中都都檢測出了HHOOC-CCH2-CH2-COOHH（琥珀酸），也也間接證明了了三羧酸循環(huán)環(huán)對PHAs合成的參與與。值得注意意的是在以可可溶性淀粉和和谷氨酸鈉為為碳源合成的的PHAs產(chǎn)物中檢測測出了3-羥基癸酸（3-hyddroxyddecanooate，HD）和3-羥基十二酸酸（3-hyddroxyddodecaanoatee，HDD），可能是是外加碳源與與菌體內(nèi)原有有脂肪酸共同同參與了PHAs的合成。同同時(shí)其中還混混有一些長鏈鏈脂肪酸（烷烷酸和烯酸），表表明菌體內(nèi)原原有的脂肪酸酸在用氯仿提提取時(shí)也被提提取出來。在在微生物菌體體內(nèi)脂肪酸的的碳原子大都都為偶數(shù)，含含量最多且普普遍存在的高高級脂肪酸有有硬脂酸、軟軟脂酸和油酸酸[5]，本研研究結(jié)果與之之相當(dāng)吻合，它它們對PHAs的性能影響響還需進(jìn)一步步研究，如以以PHAs為產(chǎn)品的生生產(chǎn)也需考慮慮提取分離技技術(shù)對純度的的影響。表3圖3aa－f中各峰所對對應(yīng)物質(zhì)圖名峰名結(jié)構(gòu)式物質(zhì)名稱圖3-a1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）圖3-b1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）圖3-c1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）圖3-d1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2CH3-CH22-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基戊酸（PHV單體）3HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）圖3-e1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2CH3-CH22-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基戊酸（PHV單體）3HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）5CH3-（CHH2）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基癸酸6CH3-（CHH2）14COOHH十六碳酸（軟脂脂酸）7CH3-（CHH2）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基十二酸酸8CH3-（CHH2）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八烯酸（油酸酸）9CH3-（CHH2）16COOHH十八碳酸（硬脂脂酸）圖3-f1CH3-CH22（OH）-CH2COOH3-羥基丁酸（PHB單體）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（內(nèi)標(biāo)物物）4CH3-（CHH2）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基癸酸5CH3-（CHH2）14COOHH十六碳酸（軟脂脂酸）6CH3-（CHH2）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羥基十二酸酸7CH3-（CHH2）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八碳烯酸（油油酸）8CH3-（CHH2）16COOHH十八碳酸（硬脂脂酸）綜合以上分析，活活性污泥作為為混合菌群，其其中存在大量量微生物。在在好氧階段一一方面可以實(shí)實(shí)現(xiàn)微生物的的增殖，另一一方面，可以以氧化生成大大量能量物質(zhì)質(zhì)（CoA），作為PHAs合成的前體體。在厭氧階階段，一部分分厭氧微生物物通過丁酸型型發(fā)酵途徑生生成β-羥酰CoA，然后PHAs聚合酶將各各個(gè)β-羥酰CoA通過酯鍵連連接成聚酯。由由于活性污泥泥是多菌群體體，不同的微微生物的代謝謝途徑不盡相相同，本研究究還將對其中中的主要儲磷磷、合成PHAs菌種進(jìn)行純純化培養(yǎng)，以以明確各個(gè)菌菌種在單一及及混合碳源下下累積PHAs的特性。4結(jié)論4.1在以乙乙酸鈉、乙醇醇、葡萄糖、可可溶性淀粉和和谷氨酸鈉為為碳源厭氧/好氧釋磷吸吸磷的研究中中發(fā)現(xiàn)，吸磷磷效率是乙醇醇（乙酸）>葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸鈉。可可溶性淀粉需需先水解為葡葡萄糖、谷氨氨酸鈉需先脫脫氨基才能進(jìn)進(jìn)一步代謝，在在厭氧階段生生成較多的小小分子有機(jī)酸酸如乙酸等有有利于好氧階階段的吸磷。4.2分別以以乙酸鈉、乙乙醇、谷氨酸酸鈉為唯一碳碳源合成PHAs為PHB，以葡萄糖糖、可溶性淀淀粉為唯一碳碳源合成PHAs為PHBV。4.3在PHHAs產(chǎn)物中檢測測出了琥珀酸酸，證實(shí)三羧羧酸循環(huán)參與與了PHAs的合成代謝謝。4.4在以可可溶性淀粉和和谷氨酸鈉為為碳源的合成成產(chǎn)物中均提提取到了硬脂脂酸、軟脂酸酸和油酸，說說明用氯仿提提取的脂肪酸酸是PHAs與菌體內(nèi)的的其它高級脂脂肪酸的混合合物。參考文獻(xiàn)[1]YuppLee,,Sangg.Baccteriaalpollyhydrroxyallkanoaates.Bioteech.&&Bioeeng.11996,49(1)):1-144[2]國家環(huán)環(huán)保局《水和和廢水監(jiān)測分分析方法》編編委會(huì)。水和和廢水監(jiān)測分分析方法（第第三版）[M]。北京：中中國環(huán)境科學(xué)學(xué)出版社，1989[3]RiiisV.,,MaiW.Gaaschrromatoographhicdeetermiinatioonofpoly--β-hydrroxybuutyriccaciddinmmicrobbialbbiomasssaftterhyydrochhloriccaciddproppanolyysis.JournnaloffChroomatoggraphyy.19888,4455:285--289[4]D.Dioniisi,CC.Levvantessi,V..Renzzietal.PPHAsttorageefrommseveeralssubstrratesbydiiffereentmoorphollogicaaltyppesinnanaanoxicc/aeroobicSSBR.WWaterSci.&Tecch.,20002,466(1-2)):337--344[5]大連輕輕工業(yè)學(xué)院主主編。生物化化學(xué)[M]。北京：輕輕工業(yè)出版社社，1981BiologiicalpphosphhorusremovvaleffficieencyaandsttructuuralaanalyssisoffPHAssbyddifferrentccarbonnsourrcesAbstracctThhemacchininngperrformaanceoofmidddle-cchain--lengtth-co--shortt–chainn-lenggthPHHAsissbettterthhanpuurePHHAs.AAnacttivateedsluudgeccultivvatedon5diffeerentsubsttratess(Soddiumaacetatte,etthanoll,gluucose,,soluublesstarchhandsodiuumgluutaminne)asstheonlycarboonsouurcessimulaatedtypiicalffoodaandfeermenttationnfacttoriesstosstudythebbiologgicalphospphorussremoovaleefficiiencyandtthechharactteristticsoofPHAAssynnthesiizediinananaerrobic//aerobbicSBBR.Thhephoosphorrusreeleaseedinaerobbicpeeriodwas110.12、1.63、7.88、2.44and55.00mmg/Lrrespecctivelly,thhephoosphorrusupptakewas00.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/Linannaerobbicpeeriod..Thetotallphossphoruusupttakeeefficiiencywaseethanool(aceetate))>gluccose>ssolubllestaarch>ssodiummgluttaminee.Theegradduallyyalkaalesceencylleadttodetteriorratetthephhosphoorusuu