第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證幻燈片

第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證概述含金屬與鹵素藥物須處理后進(jìn)行測定。處理方法視結(jié)合牢固程度而異。鹵素與芳環(huán)相連牢固；與脂肪族碳相連，結(jié)合不牢固。含金屬藥物：金屬不直接與碳相連為含金屬的有機(jī)藥物，不牢固，一般直接測定；金屬與碳相連為有機(jī)金屬藥物，須適當(dāng)處理。第一節(jié)定量分析樣品前處理方法不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法含鹵素有機(jī)藥物的分析

含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：C—X鹵原子的活潑性1.鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系乙烯型鹵和芳鹵不活潑烯丙型鹵和芐鹵活潑（3）鹵代烷型介于兩者之間含鹵素有機(jī)藥物的分析直接回流后測定法堿性或酸性還原后測定法氧瓶燃燒分解后測定法共性：鹵素原子與碳相連結(jié)合的位置不同，結(jié)合的牢固程度不同，故在樣品預(yù)處理時(shí)根據(jù)鹵素與藥物結(jié)合狀態(tài)的不同，采取不同的樣品處理方法將有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)的鹵離子，再選用適宜的分析方法。

一、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法直接測定法-鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物，如富馬酸亞鐵中鐵的測定。水解后測定法-有機(jī)鹵素藥物中鹵素與C結(jié)合不牢固藥物。本類藥物的分析特點(diǎn)是通過測定含鹵素的量來計(jì)算藥物的含量。1、直接測定法金屬元素不直接與碳原子相連的含金屬有機(jī)藥物或C-M鍵結(jié)合不牢的有機(jī)金屬藥物，在水溶液中可電離，不須破壞直接采用適當(dāng)?shù)姆椒y定如葡萄糖酸鈣中的鈣離子-EDTA絡(luò)合滴定2、經(jīng)水解后測定法方法原理（鹵素）：將含鹵素的有機(jī)藥物溶于適當(dāng)溶劑中，加氫氧化鈉或硝酸銀溶液加熱回流使其水解，將有機(jī)結(jié)合的鹵素，經(jīng)水解作用轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)鹵素離子，然后采用間接銀量法測定。如三氯叔丁醇的測定。間接銀量法：定量加入過量的AgNO3

，以硫氰酸銨為滴定劑，以硫酸鐵銨為指示劑滴定過量的硝酸銀。CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH

△回流(CH3)2-CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl

+AgNO3

AgCl↓

+NaNO3

AgNO3+

NH4SCNAgSCN↓+

NH4NO3（淡棕紅色）(Ksp=1.56×10–10)(Ksp=1.0×10-12)Fe3++SCNˉFe(SCN)2+

硫酸水解后測定法：硬脂酸鎂加定量過量硫酸使藥物水解，過量硫酸用氫氧化鈉滴定。3、經(jīng)還原后測定法堿性還原后測定方法原理；在氫氧化鈉和鋅粉存在的條件下，使有機(jī)藥物（多用于含碘有機(jī)藥物）加熱回流，發(fā)生還原裂解反應(yīng)，使有機(jī)結(jié)合的鹵素（碘）轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)鹵素離子（碘離子），繼而采用間接銀量法或其他方法進(jìn)行測定，如泛影酸的測定。適用范圍：碘原子與苯環(huán)直接相連的藥物。例泛影酸的測定

取本品約0.4g，精密稱定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于20.46mg的C11H9I3N2O4。COOHINHCOCH3IIH3COCHN+11NaOH+Zn回流△COONaNH2

H2N+3NaI+2CH3COONa+2Na2ZnO2+H2O酸性還原后測定法方法原理；在醋酸和鋅粉存在的條件下，有機(jī)藥物（多用于含碘有機(jī)藥物），發(fā)生還原裂解反應(yīng)，使有機(jī)結(jié)合的鹵素（碘）轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)鹵素離子（碘離子），采用銀量法測定鹵素離子的含量。二、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）、濕法破壞硝酸-高氯酸法：破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)激烈，需防止爆炸。適用于生物樣品的破壞，所得的無機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)。硝酸-硫酸法：適用于與碳原子結(jié)合牢固的絕大多數(shù)含金屬有機(jī)藥物的破壞分解（但不適用于含堿土金屬類有機(jī)藥物），所得的無機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)。硫酸-硫酸鹽法：常用的硫酸鹽為硫酸鉀，所得的無機(jī)金屬離子為低價(jià)態(tài)。常用于含砷或銻有機(jī)藥物的破壞分析。凱氏定氮法-含氮有機(jī)藥物定量分析方法

原理：常用凱氏定氮法測定天然有機(jī)物(如蛋白質(zhì)、核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)計(jì)算出待測物中的總氮量。CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH3

2NH3+H2SO4(NH4)2SO4

(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+H2O+Na2SO4NH3+H3BO3NH4BO2+H2ONH4BO2+H2SO4+2H2O

(NH4)2SO4+2H3BO3

（直接滴定法）還可用剩余滴定法或甲醛法滴定消解時(shí)通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。對某些難以分解的藥物（如含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)藥物），在消解過程中常還需加入輔助氧化劑，以使分解完全并縮短消解時(shí)間。常用的輔助氧化劑有過氧化氫和高氯酸，但需慎用。

某一固體樣品中的含氮量是用100g該物質(zhì)(干重)中所含氮的g數(shù)來表示(％)。因此在定氮前，應(yīng)先將固體樣品中的水分除掉。若樣品為液體(如血清等)，可取一定體積樣品直接消化測定。常量法取供試品的量約相當(dāng)于含氮量25~30mg，半微量法供試品取樣量約相當(dāng)于含氮量1.0~2.0mg。中國藥典用本法測定含有氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥物含量。對于以偶氮或肼等結(jié)構(gòu)存在的含氮藥物，因在消解過程中易于生成氮?dú)舛鴵p失，須在消解前加鋅粉還原后再依法處理；而雜環(huán)中的氮因不易斷鍵而難以消解，可用氫碘酸或紅磷還原為氫化雜環(huán)后再行消解。對于含氮量較高的樣品（超過10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作為還原劑，以利于氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?。（二）、干法破?、高溫?zé)胱品▽⒂袡C(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。將適量樣品置于瓷坩堝或鉑坩堝中，加入無水碳酸鈉、氫氧化鈣或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化，混勻后，先小火加熱使樣品完全炭化，然后高溫灼燒，使其完全灰化。本法適用于濕法不易破壞完全的藥物以及不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。2、氧瓶燃燒法系指將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐校缓蟾鶕?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別，檢查或含量測定。適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析本法簡便、快速、破壞完全，尤其用于微量樣品分析基本原理有機(jī)物充O2燒瓶燃燒產(chǎn)物吸收液→分析儀器裝置和設(shè)備（1）燃燒瓶（2）稱樣材料及稱樣方法無灰濾紙：適用于固體；紙袋：適用于液體（3）氧氣：采用鋼瓶氧氣,防止導(dǎo)氣管污染。（4）吸收液作用：定量吸收供試品的燃燒分解產(chǎn)物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌跍y定的價(jià)態(tài)。藥物破壞后吸收液定量方法含氟氟化氫水硒素氟藍(lán)比色法含氯氯化氫NaOH水溶液銀量法含溴溴+溴化氫NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含碘各種價(jià)態(tài)碘NaOH水溶液+還原劑SO2銀量法含硫三氧化硫H2O2溶液重量法含磷五氧化二磷水磷鉬藍(lán)比色法含硒四價(jià)硒+少量六價(jià)硒硝酸溶液二氨基萘比色法選擇原則：被測物質(zhì)的種類及所用分析方法3、注意事項(xiàng)：（1）燃燒瓶：大小適宜、干凈、有防爆措施（2）氧氣要充足：燃燒完全（不得有黑色炭化物）（3）產(chǎn)生煙霧應(yīng)完全被吸收：充分振搖煙霧顏色：碘，紫色；溴，紅棕色；氟、氯,白（4）測定氟化物：石英制燃燒瓶

待分解樣品量

燃燒瓶的體積3~5mg（微量分析）150~250ml20~30mg（半微量分析）300~500ml50~60mg1000ml0.6~0.7g或更多2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶

正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。第二節(jié)定量分析方法特點(diǎn)

一、容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)

操作簡單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.5%）；儀器普通易得。1.滴定度（T）的概念每1ml滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg)2.滴定度的計(jì)算aA+bBcC+dD

T=M×a/b×B3.百分含量的計(jì)算（原料藥）（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度

（二）容量分析法的計(jì)算問題（2）剩余滴定法

T——滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測組分的mg數(shù)

V——滴定時(shí)，供試品消耗滴定液的體積（ml）

V0——滴定時(shí)，空白消耗滴定液的體積（ml）F——濃度校正因子

ms——供試品的質(zhì)量

雙相滴定法測定苯甲酸鈉含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml與甲基橙3滴，用0.1062mol/L鹽酸滴定，至水層顯橙紅色，分取水層，置具塞錐形瓶中，加乙醚20ml，振搖，繼續(xù)滴定至持續(xù)橙紅色，消耗鹽酸體積21.05ml。計(jì)算樣品中苯甲酸鈉含量。苯甲酸鈉分子量144.1。司可巴比妥的含量測定：取供試品0.1301g，置碘量瓶中，加水10ml，振搖使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L)25ml，再加鹽酸5ml，立即密塞并振搖1min，暗處靜置15min后，加碘化鉀試液10ml，立即密塞搖勻，用0.0999mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定，至近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。已知：樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.1mol/L)相當(dāng)于13.01mg的司可巴比妥。計(jì)算含量片劑含量測定結(jié)果的計(jì)算

煙酸片含量測定

取本品10片,精密稱定為3.5840g,研細(xì),精密稱取0.3729g,置100mL錐形瓶中,置水浴加熱溶解后,放冷.加酚酞指示劑3滴,用氫氧化鈉滴定液（0.1005mol/L),滴定至粉紅色,消耗25.02mL.每1mL氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)12.31mg的煙酸.求供試品中煙酸的標(biāo)示百分含量（標(biāo)示量0.3g/片）標(biāo)示量%=V×T×F×平均片重W×標(biāo)示量×100%=25.02×12.31/1000×0.1005/0.1×0.35840.3729×0.3=99.17%×100%

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法（200nm～760nm)

靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～

10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2%～5%

儀器價(jià)格低廉操作簡單，易普及，應(yīng)用廣

2.定量：朗伯-比耳定律A=E1%1cmCL

3.儀器校正和檢定

波長校正用汞燈中較強(qiáng)譜線237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與576.96nm

或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。

吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波長(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測定波長透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8

NaNO2

5.00340nm＜0.84.對溶劑的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.測定方法要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%

常用方法吸收系數(shù)法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

計(jì)算分光光度法：VA的三點(diǎn)校正法比色法定量計(jì)算方法（1）對照法

硫噴妥鈉的含量測定：取供試品0.2500g，用水稀釋至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀釋至100ml，作為供試品溶液；另取硫噴妥對照品用0.4%NaOH溶液配制濃度為5μg/ml作為對照品溶液。照分光光度法，在304nm波長處分別測得供試品和對照品的吸收度為0.520和0.545，已知1mg硫噴妥相當(dāng)于1.091mg的硫噴妥鈉，試計(jì)算硫噴妥鈉的含量（2）吸收系數(shù)法

對乙酰氨基酚的含量測定方法為

精密稱取本品40.1mg，置250ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50ml溶解后，加水至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10ml，加水至刻度，搖勻。在257nm的波長處測定吸收度為0.570，按C8H9NO2的百分吸收系數(shù)為715計(jì)算。

（二）熒光分光光度法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～

10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用

1.特點(diǎn)

用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少。

2.熒光分析儀有二個(gè)單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。含量測定常用的方法對照品比較法:

Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×Cr

Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。

三、色譜分析法

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜方法分類按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC，HPLC。

（一）HPLC法

1.對HPLC儀器一般要求色譜柱、流動(dòng)相按品種項(xiàng)下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5

重復(fù)性：RSD≤2%

拖尾因子：T=W0.05h/2d1應(yīng)在0.95～1.05

正常峰和不正常峰如何判斷？用拖尾因子（對稱因子）：T

T=W0.05h/2AT：0.95~1.05

對稱峰>1.05

拖尾峰<0.95前沿峰

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3.測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法含量=×CRAXAR

外標(biāo)一點(diǎn)法：一種濃度對照物對比樣品中待測組分含量前提：截距接近0，對照品濃度與待測組分濃度接近內(nèi)標(biāo)法：對內(nèi)標(biāo)物要求：a．內(nèi)標(biāo)物須為原樣品中不含組分b．內(nèi)標(biāo)物與待測物保留時(shí)間應(yīng)接近且R>1.5c．內(nèi)標(biāo)物為高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或含量已知物質(zhì)校正因子（f）=AS/CSAR/CR含量（CX）=fA’S/CS’AX內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量不超量時(shí)，重復(fù)性及操作條件對結(jié)果無影響只需待測組分和內(nèi)標(biāo)物出峰，與其他組分是否出峰無關(guān)。內(nèi)標(biāo)法缺點(diǎn)：制樣要求高；須尋找合適內(nèi)標(biāo)物外標(biāo)法特點(diǎn)：

1）不需要校正因子，不需要所有組分出峰

2）結(jié)果受進(jìn)樣量、進(jìn)樣重復(fù)性和操作條件影響大

→每次進(jìn)樣量應(yīng)一致，否則產(chǎn)生誤差例：醋酸氫化可的松的含量采用HPLC法測定：取本品對照品適量，精密稱定，加甲醇定量稀釋成每ml約含0.35mg的溶液。精密量取該溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（0.30mg/ml炔諾酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。已知：對照品取樣為36.2mg，樣品取樣為35.5mg，測得對照液中醋酸氫化可的松和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5467824和6125843，樣品液中藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別為5221345和6122845，計(jì)算本品的含量需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目1.鑒別試驗(yàn)；2.雜質(zhì)定量或限度檢查；3.原料或制劑中有效成分含量測定；4.制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；5.溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法。第三節(jié)藥品分析方法的驗(yàn)證一、準(zhǔn)確度

是指用該方法測定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度

1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。

2.制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD。具體做法：測定高、中、低三個(gè)濃度（n=3）,共9個(gè)數(shù)據(jù)來評價(jià)，回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%

二、精密度

是指在規(guī)定的測試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果之間的接近程度。

（一）精密度表示方法

1.偏差(deviation,d)d=測得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性

1.重復(fù)性在相同條件下,由一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度.2.中間精密度在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。

3.重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。

三、專屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。

（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

（二）含量測定和雜質(zhì)測定色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。

圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用已驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對照；也可用對試樣加速破壞的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

四、檢測限

是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法

1.非儀器分析目視法用已知濃度被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

2.儀器分析方法GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

五、定量限

是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時(shí)，要求

LOQ.

常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)，相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。

六、線性

是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

UV法：首先制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5;A=0.3～0.7

建立回歸方程C=aA+b;r＞0.999。

HPLC法：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5～7;以C對h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.999。

七、范圍

是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%～

120%。制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測試濃度的70%～

130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應(yīng)為限度的±20%。

八、耐用性

是指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度。典型的變動(dòng)因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、

時(shí)間等。

HPLC法變動(dòng)因素有：流動(dòng)相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。

GC法變動(dòng)因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。分析方法效能指標(biāo)的要求1、非定量方法：用于鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)的限量檢查，只對專屬性、耐用性和檢測限有要求，其余均無須要求。2、用于原料藥中主成分或制劑中有效成分含量測定及溶出度測定，除了檢測限和定量限外，其余均要求。3、雜質(zhì)測定或制劑中降解物測定：屬于微量定量分析，除檢測限不必要求外，其余七項(xiàng)指標(biāo)均應(yīng)有所要求。第四節(jié)、生物樣品分析方法的基本要求1、被測定的藥物和代謝物的濃度低；2、樣品大多需要分離和凈化；3、樣品量少，連續(xù)測定時(shí)，很難再度獲得完全相同的樣品。4、工作量較大，5、要求很快地提供結(jié)果(毒物檢測)一、樣品的種類、采集和貯藏（一）血樣：血漿、血清血漿：選用最多。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內(nèi)的狀況。而且血漿中藥物濃度的數(shù)據(jù)報(bào)道較多，可供借鑒。血漿是全血在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取，量約為全血的一半。血清則是在血液中纖維蛋白元等影響下，自然凝結(jié)引起析出血塊，離心取得。

（二）、唾液：唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。

（三）尿樣：尿樣測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定代謝物類型等。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿樣常需加入防腐劑。

貯藏血漿和血清需采集后及時(shí)分離，一般最遲不超過2h，分離后再置冰箱或冷凍柜中保存。尿樣應(yīng)立即測定，若收集24h的尿液不能立即測定時(shí)，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐劑，一般可保存2436h，也可加入疊氮化鈉可較長時(shí)間保存。唾液在保存過程中會放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，須離心后冷藏或冷凍二、生物樣品的預(yù)處理技術(shù)樣品的制備要考慮：藥物的理化性質(zhì)、藥物測定的目的、選用的生物體液和組織的類型、待測物的濃度范圍、樣品制備與分析技術(shù)的關(guān)系。

待測藥物的理化性質(zhì)藥物的pKa值、親脂性、溶解度等——預(yù)處理及檢測方法具有親脂性——在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取具有強(qiáng)極性或親水性——沉淀蛋白、固相萃取、離子對HPLC法藥物的穩(wěn)定性——萃取濃縮技術(shù)對酸堿不穩(wěn)定——酯、酰胺、兩性藥物避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑，流動(dòng)相pH對熱不穩(wěn)定——避免高溫蒸發(fā)溶劑具有揮發(fā)性——GC測定法具有光譜或電化學(xué)特性——HPLC分析檢測方法

待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物分析檢測技術(shù) 濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存）

——代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時(shí)測定

——采用色譜法、LC-MS、EIA等分析檢測技術(shù)分析測定的目的與要求

藥代動(dòng)力學(xué)——研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程

——血漿濃度隨時(shí)間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物

要求 ——同時(shí)測定原形藥物和代謝產(chǎn)物

檢測 ——寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)

方法 ——大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS分析測定的目的與要求

臨床治療藥物監(jiān)測

有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度

方法——盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定

——大多采用UV、RIA或EIA等

中毒患者的臨床搶救

藥物濃度可能很高

方法——強(qiáng)調(diào)方法的特異性和分析速度

——大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA、EIA、HPLC或HPLC-MS。生物樣品的類型與預(yù)處理方法

生物樣品的類型與預(yù)處理方法以血漿或血清為分析樣品

采用蛋白沉淀-溶劑萃取預(yù)處理技術(shù)

——分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測

用RIA分析

——樣品的預(yù)處理方法可較為粗放

——經(jīng)過簡單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測定實(shí)驗(yàn)室條件

在設(shè)計(jì)體內(nèi)藥物分析方法時(shí)，還應(yīng)充分考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的或有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。（一）、蛋白質(zhì)的去除

是測定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中藥物時(shí)的最先處理步驟。1、加入可與水混合的有機(jī)溶劑：破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使與蛋白結(jié)合狀態(tài)的藥物釋放，將混合物超速離心，取上清液作為樣品。

2、加入中性鹽使蛋白脫水而沉淀，硫酸銨最常用3、加入強(qiáng)酸與蛋白形成沉淀，陰離子型沉淀劑。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的藥物不宜用本法去蛋白。4、加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑與蛋白形成沉淀，陽離子型沉淀劑（二）、輟合物的水解：酸水解法：強(qiáng)酸、加熱酶解：蛋白水解酶中的枯草菌溶素使組織酶解，并使藥物析出。優(yōu)點(diǎn)：可避免藥物在酸中水解及較高溫度時(shí)降解；水解可顯著改善對蛋白結(jié)合強(qiáng)的藥物的回收率；可用有機(jī)溶劑直接提取消化液而無乳化生成。

（三）有機(jī)破壞

當(dāng)測定生物樣品中的金屬離子時(shí)，通常使用硝酸-高氯酸作為消解劑，破壞后所得的金屬離子為高價(jià)態(tài)。又如凱氏定氮法等。（四）分離、純化與濃集當(dāng)藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時(shí)，生物樣品需分離、純化與濃集。1、液-液萃取溶液的pH調(diào)節(jié)：最佳pH選擇主要與藥物的pKa值有關(guān)。體內(nèi)酸性物質(zhì)較多，在堿性條件下不會被有機(jī)溶劑萃取出來，而且多數(shù)藥物堿性，故在pH值偏高的情況下進(jìn)行提取較好。提取溶劑：選好提取溶劑可減少以后的凈化操作，在液-液提取中盡量采用極性小的溶劑。提?。哼M(jìn)行一次（至多二次）提取，濃集：常用吹氮?dú)馐谷軇]散，或減壓蒸發(fā)（注意暴沸）。酸堿度的選擇酸性藥毒物：pH應(yīng)低于藥毒物pKa值1~2個(gè)單位堿性藥毒物：pH應(yīng)高于藥毒物pKa值1~2個(gè)單位

可保證90%以上藥毒物解離注意酯、酰胺、亞酰胺、苷類藥毒物易分解離子對提取法：

提取極性大的藥物。一些酸性或堿性有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài)，變成親水性強(qiáng)的帶電荷離子，即使控制pH值也不能抑制其電離，使其不能用有機(jī)溶劑從體液中提取出來。對于呈離解狀態(tài)的藥物，當(dāng)添加與藥物離子呈相反電荷的反離子，即可成為具有一定脂溶性的離子對，用有機(jī)溶劑將其從水相中提取分離。

測定堿性藥物時(shí)，一般用烷基磺酸鹽類（RSO3H）作為反離子，如庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等；測定酸性藥物時(shí)一般用烷基季銨類化合物作為反離子，如氫氧化四丁基銨、四乙基銨鹽等。

液液萃取優(yōu)點(diǎn)：可將大部分內(nèi)源性雜質(zhì)去除；經(jīng)濟(jì)實(shí)用、可使樣品富集、可一次進(jìn)行多個(gè)樣品萃取缺點(diǎn)：乳化、污染環(huán)境、乳化的去除：加少量固體氯化鈉到水相中可減輕乳化；輕微乳化離心；嚴(yán)重乳化低溫冰箱快速冷凍破壞乳化層后融化離心。2、液-固萃取法：

以固相分離方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，從水相中分離出所需測定的組份，通常以柱分離方式進(jìn)行操作，故有時(shí)這種方法又稱為固相提取活化上樣淋洗洗脫洗脫液濃集實(shí)驗(yàn)步驟

第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料第二步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱—除去大部分甲醇第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液第四步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除內(nèi)源性雜質(zhì)第五步：選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫?，收集洗脫液，揮干溶劑，備用或直接進(jìn)行在線分析

血漿樣品可直接上柱，樣品量0.1~2ml，流速1~2ml/min

柱切換高效液相色譜技術(shù)是指由閥來改變流動(dòng)相走向與流動(dòng)相系統(tǒng)，從而使洗脫液在一特定時(shí)間內(nèi)從預(yù)處理柱進(jìn)入分析柱的技術(shù)。用兩個(gè)或兩個(gè)以上柱子連接構(gòu)成色譜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使不同柱子達(dá)到不同分離目標(biāo)，柱子間用切換閥聯(lián)結(jié)，這就是柱切換技術(shù)?；驹硎鞘紫仍陬A(yù)柱上實(shí)現(xiàn)生物體液中干擾大分子與待測藥物的分離，然后用柱切換將待測藥物從預(yù)柱轉(zhuǎn)移至分析柱上完成色譜分析。在線生物樣品制備-柱切換高效液相色譜法（五）、化學(xué)衍生化1、使藥物變成能被分析的性質(zhì)2、提高檢測靈敏度3、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性4、提高對光學(xué)異構(gòu)體分離的能力氣相色譜衍生化液相色譜衍生化衍生化方法

硅烷化、?；⑼榛?dú)庀嗌V衍生化方法紫外衍生化、熒光衍生化、電化學(xué)衍生化、手性衍生化—液相色譜衍生化方法柱前衍生柱后衍生三、生物樣品定量分析方法驗(yàn)證1、特異性：空白、空白加樣、用藥后的譜圖2、標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍：介質(zhì)相同、包含所有濃度點(diǎn)3、精密度與準(zhǔn)確度：高中低三個(gè)濃度4、定量下限：一般最高濃度的1/10-1/205、樣品穩(wěn)定性：冰凍、凍融穩(wěn)定性、復(fù)溶溶液穩(wěn)定性6、提取回收率：高、中、低濃度7、質(zhì)控樣品：隨行標(biāo)準(zhǔn)8、質(zhì)量控制：生物樣品測定分離條件的篩選

在進(jìn)行分離條件篩選時(shí)，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下：

1．空白溶劑試驗(yàn)

——溶劑(方法特異性) 2．空白生物基質(zhì)試驗(yàn)

——內(nèi)源性物質(zhì)干擾(方法特異性) 3．模擬生物樣品試驗(yàn)

——方法驗(yàn)證（效能指標(biāo)）

4．實(shí)際生物樣品測試——代謝產(chǎn)物(方法特異性)（一）、方法特異性(專屬性或選擇性)

方法的特異性(specificity)

——又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?，通常與選擇性(selectivity)互用

——系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力 專屬性——表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物所特有的 選擇性——系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

考察一個(gè)分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)：1.內(nèi)源性物質(zhì)的干擾比較——待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號；2.代謝產(chǎn)物的干擾比較——模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測信號；3.伍用藥物的干擾還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物(通常為數(shù)有限)的干擾。提供三張色譜圖，空白生物樣品圖、空白加對照、實(shí)際生物樣品圖（二）、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）

——生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性

——除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式

——回歸