高滴度的生長(zhǎng)分化因子-15多克隆抗體制備,基因工程論文

高滴度的生長(zhǎng)分化因子-15多克隆抗體制備,基因工程論文生長(zhǎng)分化因子〔growthdifferentiationfactor-15,GDF-15〕又名MIC-1、PDF、PLAB、PTGFB或NAG-1,是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子〔TGF-〕超家族成員[1].GDF-15是一種分泌型二聚體蛋白，其基因位于19號(hào)染色體的p12.1-13.1,翻譯后的前體蛋白由308個(gè)氨基酸殘基組成，經(jīng)剪切生成2條含112個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，再通過(guò)分子間二硫鍵構(gòu)成同源二聚體的成熟形式后，分泌到胞外發(fā)揮功能[2].GDF-15高表示出于胎盤(pán)和成人的前列腺組織中，而在其他組織中低表示出。在病理和應(yīng)激環(huán)境下，GDF-15的表示出量明顯升高。多項(xiàng)研究表示清楚，GDF-15不但介入免疫反響[4-5],與多種心臟疾病的診斷、預(yù)后存在相關(guān)性[3],而且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,7].大量文獻(xiàn)表示清楚GDF-15在很多腫瘤組織中高表示出，能夠作為結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌的血清早期診斷標(biāo)志物[8].與其他TGF-超家族成員類似，GDF-15能夠通過(guò)活化細(xì)胞外表TGF-Ⅰ型和Ⅱ型受體，進(jìn)而募集并激活下游Smad信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能，可能在腫瘤發(fā)生的早期階段發(fā)揮抑瘤作用，而在晚期階段轉(zhuǎn)而促瘤[9-10].本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[6],是潛在的腫瘤治療靶標(biāo)，我們擬采用抗體特異性阻斷的方式方法在動(dòng)物水平檢驗(yàn)其靶向治療的可行性。但市售的GDF-15抗體種類少、價(jià)格高，難以知足實(shí)驗(yàn)需求。因而，在本研究中，我們通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建重組融合蛋白GDF-15的原核表示出系統(tǒng)，獲得純度較高的抗原蛋白，在這里基礎(chǔ)上制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，為后續(xù)靶向治療研究的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。1材料與方式方法1.1材料BALB/c小鼠來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HT29、sw480、caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)自ATCC;大腸桿菌BL21、DH5，pET-32a〔+〕載體由本實(shí)驗(yàn)室提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；抗GDF-15抗體購(gòu)自Abnova公司；兔抗人-actin一抗、HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自中杉金橋公司；其他試劑均為分析純產(chǎn)品。據(jù)已報(bào)道的人GDF-15基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)上游引物〔5-CGGGATCCATGGCGCGTGCGCG-3〕和下游引物〔5-CCCTCGAGCTATATGCAGTGGCAGTCTTTGG-3〕，由上海生工公司合成。1.2重組質(zhì)粒pET-32a〔+〕-GDF-15的構(gòu)建提取人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)計(jì)GDF-15特征性引物，體外擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收克隆片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到經(jīng)同樣雙酶切的pET-32a〔+〕載體上，將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，接種到含氨芐西林的LB瓊脂糖培養(yǎng)板中，37℃孵箱中培養(yǎng)12h,挑選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET32a〔+〕-GDF-15.1.3重組GDF-15的誘導(dǎo)表示出和純化將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，挑選單克隆，將含pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，參加終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)6h后收集菌體，參加5倍SDS上樣緩沖液，混勻煮沸10min,12000r/min離心5min,SDS鑒定GDF-15的表示出。經(jīng)SDS鑒定挑選出GDF-15高表示出的菌落，誘導(dǎo)表示出，離心收集菌體，將菌體重懸于細(xì)菌裂解緩沖液中，冰上超聲波裂解〔功率300W,超聲5s,間歇10s〕，離心20min,棄上清，用8mol/L尿素溶解包容體。離心后取上清進(jìn)行Ni親和層析純化，以10倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌3次，洗脫緩沖液洗脫重組蛋白并收集，SDS檢測(cè)純化后的GDF-15蛋白。1.4GDF-15蛋白的復(fù)性與鑒定對(duì)變性的蛋白進(jìn)行復(fù)性，分別用8、6、4、2mol/L尿素和不含尿素的PBS溶液對(duì)GDF-15蛋白進(jìn)行透析，每次6h;對(duì)復(fù)性后的蛋白經(jīng)SDS鑒定相對(duì)分子質(zhì)量；SDS后，用300mA電流轉(zhuǎn)膜1h,室溫封閉2h,用1∶3000稀釋的GDF-15一抗于4℃孵育過(guò)夜，用1∶5000稀釋的二抗于室溫孵育1h,Western印跡鑒定能否為GDF-15蛋白。1.5GDF-15多克隆抗體的制備將純化的蛋白用PBS稀釋并與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫6~8周齡雄性BALB/c小鼠〔80g/每只〕；2周后，將蛋白與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化后加強(qiáng)免疫；每2周加強(qiáng)免疫一次，末次免疫14d后取血，分離血清，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?.6GDF-15多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)采用間接ELISA檢測(cè)抗體滴度。用100ng/200LGDF-15包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜后棄掉液體，參加5mg/LBSA封閉緩沖液〔0.1mol/LNaHCO3,pH8.6〕于37℃封閉2h;傾去液體，用TBST〔1mL/LTween-20,TBS〕洗5次，每次2min;每孔參加HRP標(biāo)記的小鼠二抗抗體〔1∶5000〕100L,37℃孵育1h;用TBST洗3次，參加OPD顯色液，37℃顯色15min;參加2mol/L硫酸終止反響，用酶標(biāo)儀測(cè)定D490nm值，P/N大于2.1為陽(yáng)性，設(shè)立陰性對(duì)照為無(wú)關(guān)蛋白包板。1.7GDF-15多克隆抗體特異性鑒定取人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480、caco-2,參加強(qiáng)效裂解液，冰上裂解1h,4℃、12000r/min離心20min,BCA法定量蛋白濃度，參加5倍上樣緩沖液煮沸10min,經(jīng)常規(guī)SDS后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%BSA室溫封閉1h,參加1∶500稀釋的抗血清，4℃孵育過(guò)夜，洗滌后用1∶5000稀釋的辣根酶標(biāo)記的抗鼠二抗室溫孵育1h,洗滌后ECL顯色，壓片，保存結(jié)果。2結(jié)果2.1GDF-15cDNA片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的制備用特異的上下游引物從結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的cDNA中擴(kuò)增出GDF-15基因，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1,擴(kuò)增片段約350bp.將目的基因插入pET-32a〔+〕載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-32a〔+〕-GDF-15,也在約350bp處可見(jiàn)GDF-15特異性條帶〔圖2〕，與預(yù)期結(jié)果一致。將獲得的pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果正確，講明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2GDF-15蛋白的誘導(dǎo)表示出及純化將轉(zhuǎn)化pET-32a〔+〕-GDF-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21培養(yǎng)后用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h,用全菌進(jìn)行SDS,結(jié)果見(jiàn)圖3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在Mr約28103處出現(xiàn)明顯的表示出產(chǎn)物條帶。超聲波裂菌后，上清液經(jīng)Ni親和層析柱純化，250mmol/L咪唑洗脫獲得目的蛋白峰〔圖4〕，PBS透析后行SDS,顯示蛋白條帶位置正確、純度較好〔圖5〕。2.3GDF-15蛋白的鑒定將純化的蛋白行Western印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示原核表示出的GDF-15融合蛋白能夠被特異性抗體辨別，抗原性良好〔圖6〕。2.4GDF-15多克隆抗體的制備和效價(jià)檢測(cè)將純化的GDF-15蛋白混合弗氏佐劑，皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，進(jìn)行1次基礎(chǔ)免疫和3次加強(qiáng)免疫，末次免疫后14d取血，分離血清，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)1∶100000〔圖7〕。2.5GDF-15多克隆抗體檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性GDF-15的表示出以人結(jié)腸癌細(xì)胞系sw480、caco-2為檢測(cè)對(duì)象，采用本實(shí)驗(yàn)制備的GDF-15抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，抗體能夠檢測(cè)到胞內(nèi)GDF-15,產(chǎn)生特異性條帶〔圖8〕，講明GDF-15抗體制備成功，可應(yīng)用于后續(xù)研究工作中。3討論GDF-15在調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反響、炎癥反響及成體急性損傷修復(fù)經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著重要作用[11],而在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的功能研究尤為人們關(guān)注。針對(duì)前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的研究顯示，GDF-15在血清中的含量與腫瘤組織惡性程度、細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力都存在明顯的相關(guān)性。還有文獻(xiàn)報(bào)道，GDF-15能夠介導(dǎo)腫瘤誘發(fā)的消瘦和厭食癥。不僅講明循環(huán)系統(tǒng)中的GDF-15水平能夠作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志，而且這些表示出于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的GDF-15也是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。為了用抗體封閉GDF-15,以研究其在腫瘤中的功能及其靶向藥物的應(yīng)用前景，我們首先要獲得大量的抗原蛋白。當(dāng)前市售的GDF-15多為CHO細(xì)胞表示出，成本高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。因而，我們將人GDF-15序列克隆至原核表示出載體pET-32a〔+〕中，構(gòu)建了重組表示出質(zhì)粒，并建立了經(jīng)濟(jì)、高效的GDF-15原核表示出系統(tǒng)。在這里基礎(chǔ)上，我們用傳統(tǒng)方式方法制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，通過(guò)Western印跡檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞sw480、caco-2中GDF-15的表示出，表示清楚我們制備的抗體能有效辨別人源GDF-15分子。以上結(jié)果為我們后續(xù)研究GDF-15靶向治療及其生物學(xué)功能和信號(hào)傳導(dǎo)通路奠定了基礎(chǔ)。以下為參考文獻(xiàn)[1]ConstamDB,RobertsonEJ.Regulationofbonemorphogeneticproteinactivitybyprodomainsandproproteinconvertases[J].JCellBiol,1999,144〔1〕：139-149.[2]UnsickerK,SpittauB,KrieglsteinK.ThemultiplefacetsoftheTGF-familycytokinegrowth/differentiationfactor-15/macrophageinhibitorycytokine-1[J].CytokineGrowthFactorRev,2020,24〔4〕：373-384.[3]SchlittenhardtD,SchoberA,StrelauJ,etal.Involvementofgrowthdifferentiationfactor-15/macrophageinhibitorycytokine-1〔GDF-15/MIC-1〕inoxLDL-inducedapoptosisofhumanmacrophagesinvitroandinarterioscleroticlesions[J].CellTissueRes,2004,318〔2〕：325-333.[4]ZhouZ,LiW,SongY,etal.Growthdifferentiationfactor-15suppressesmaturationandfunctionofdendriticcellsandinhibitstumor-specificimmuneresponse[J].PLoSOne,2020,8〔11〕：e78618.[5]RothP,JunkerM,TritschlerI,etal.GDF-15Contributestoproliferationandimmuneescapeofmalignantgliomas[J].ClinCancerRes,2018,16〔15〕：3851-3859.[6]StrelauJ,SchmeerC,PeterzielH,etal.Expressionandputa?tivefunctionsofGDF-15,amemberoftheTGF-betasuperfamily,inhumangliomaandglioblas