DB34T 173-1999公共場所微生物采樣方法與檢驗技術(shù)規(guī)范

1999—01—01發(fā)布1999—01—01實施前言 2引用標(biāo)準(zhǔn) 3監(jiān)測點的選擇與監(jiān)測頻率 5現(xiàn)場采樣操作的質(zhì)量控制 6樣品送檢的質(zhì)量控制 本標(biāo)準(zhǔn)是與GB9663～9673—1996、GB16153—1996衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中微生物指標(biāo)相配套的采樣方標(biāo)準(zhǔn)中附錄A、附錄B、附錄C為標(biāo)準(zhǔn)附錄。1公共場所微生物采樣方法與檢驗技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了公共場所微生物檢測的選點與采樣頻率、采樣方法與檢驗本標(biāo)準(zhǔn)適用于公共場所室內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù)；公用茶具、毛巾、床上臥腸菌群、致病菌以及臉(腳)盆、浴(缸)盆、座墊、拖鞋中的致病菌的采樣與檢驗工作。2引用標(biāo)準(zhǔn)下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成本標(biāo)本均為有效。所有的標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討GB14934—94食(飲)具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T17220—1998公共場所衛(wèi)生監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3監(jiān)測點的選擇與監(jiān)測頻率4采樣方法與檢驗技術(shù)規(guī)范4.1公共場所空氣中細(xì)菌總數(shù)4.1.1采樣點、采樣高度與頻率采樣時選擇對空氣中的細(xì)菌捕獲率達(dá)95%的撞擊式空氣微生物采樣器，按照儀器使用說明的要求對儀器外表進(jìn)行處理，對采樣裝置進(jìn)行清潔滅菌；將采樣時間定的采樣時間檔上，采樣時間的選擇視采樣點空氣含菌量的大致估計情況而定。帶所3’檔，一般公共場所1’～2’檔，將事先準(zhǔn)備好的滅菌采樣平皿按說明書要求仔細(xì)安裝好后，即可進(jìn)行采樣，流量以25L/min為宜。采祥結(jié)束后，仔細(xì)取下平皿，放于平皿儲存器中，樣品采完后，將帶菌營養(yǎng)瓊脂平板置36±1℃恒溫箱中，培養(yǎng)48=2h,計數(shù)菌落數(shù)，并安徽省技術(shù)監(jiān)督局1999—01—01批準(zhǔn)1999—01—01實施2設(shè)置3-5個采樣點，設(shè)3點時即室內(nèi)墻角與對角墻角均勻布3點，設(shè)5個點時即室內(nèi)墻角對角線交點為1采樣點。該交點與四墻角連線的中點為另外4個采樣點。采樣高度為1.2~1.5m。2,以代表全皿菌落數(shù)。3選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告。若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300之間，則應(yīng)求出兩個稀釋度菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2,應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于，2則報告其中稀釋度鉸低的平皿菌落若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告若所稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一個稀釋度平均菌落數(shù)大于300,而相鄰的另一個稀釋度平均菌落數(shù)小于30,則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每ml小于1cfu。菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)可用10按附錄B執(zhí)行。紙片法：用滅菌生理鹽水濕潤Scm×5cm大腸菌群快速測定紙片兩張，分別粘貼在茶具內(nèi)、外緣口唇接觸處，約30s后取下，置于無菌塑料袋內(nèi)4h內(nèi)送檢。發(fā)酵法：用測定細(xì)菌總數(shù)剩余的檢樣，倒入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中，置36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。自推測性檢驗陽性管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)種伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實性試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進(jìn)行染色鏡檢；同時接種乳糖發(fā)酵管，置36紙片法：將已采樣的紙片置36=1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18h,觀察結(jié)果，44.3.1采樣部位毛巾、枕巾(套)采樣：應(yīng)在毛巾、枕巾(套)對折后兩面的中央5cm×采樣方法(涂抹法)檢驗方法按執(zhí)行。菌落計數(shù)方法按執(zhí)行；按下列公式計算菌落報告方式按執(zhí)行。檢驗方法按本標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5證實試驗：挑取可疑大腸桿菌菌落1-2個，進(jìn)行革蘭采樣方法按執(zhí)行。將大腸菌群檢測后剩余的5ml待檢樣品，放入7.5%的氯化鈉肉湯45ml或膜酪胨大豆肉湯從培養(yǎng)液中取1～2接種環(huán)，劃線接種在BairdPairker氏培養(yǎng)基(或用血平皿),于36=1℃6試管法：吸取1:4新鮮血漿0.5ml放入滅菌小試管中再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.將無菌棉試子蘸取無菌生理鹽水，在每只拖鞋規(guī)定的部位和面積上涂抹采樣后，用反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開，此液為1:10稀釋液。用滅菌吸管吸取1:10檢液2ml,分別注入到2個滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml另取1ml注人9ml加有玻璃珠的滅菌鹽水管中，換1支1ml滅菌吸管吹吸5次，此液為1:100稀釋液。7通常選擇菌落數(shù)在30～100之間的平皿進(jìn)行計數(shù)，同稀釋的兩個平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每ml檢樣中所含真菌數(shù)。若有兩個稀釋度的菌落數(shù)皆在規(guī)定范圍之間或三個稀釋度4.5.6結(jié)果報告 注：一只拖鞋的涂抹面積是5cm×5cm=25cm2;一雙拖鞋的涂抹面積則為25cm2×2=4.6浴盆、臉(腳)盆中微生物4.6.1采樣部位采樣必須在無菌操作下進(jìn)行，采樣用具高壓滅菌121℃20min,臉(腳)盆采樣時應(yīng)在盆內(nèi)壁1/2～1/3高度涂抹一圈采樣。浴盆應(yīng)在盆內(nèi)四壁及盆底呈梅花狀布點。4.6.2細(xì)菌總數(shù)設(shè)備與材料按附錄B執(zhí)行。采樣方法涂抹法：用漫有無菌生理鹽水的棉拭子在規(guī)格板(5cm×5cm)內(nèi)來回均勻涂滿整個方格，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，剪去手接觸部位后，將涂抹浴盆的5個棉拭子一并放入125ml的生理鹽水燒瓶中，涂抹臉(腳)盆的2個棉拭子一并放入50ml的生理鹽水三角燒瓶中，充分振搖或在旋渦振蕩器上振蕩1min,此1mL的菌濃度相當(dāng)1cm2的菌量。斑貼法：將5cm×5cm無菌濾紙片放入滅菌平皿中，注入滅菌生理鹽水1ml/片(吸滿為止),以無菌操作將濾紙片貼到采樣部位，1min后按序取下，將貼浴盆的5片濾紙一并放入125ml生理鹽水瓶中，貼臉(腳)盆的2片濾紙一并放入50ml生理鹽水瓶中，充分振播或在旋渦振蕩器上振蕩1min,此1ml的菌濃度相當(dāng)于1cm2的菌量。檢驗方法按執(zhí)行。菌落計數(shù)方法按執(zhí)行；按下列公式計算：菌菌總數(shù)(CFU/25cm2)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×25………………(4)菌落計數(shù)的報告按執(zhí)行。4.6.3大腸菌群設(shè)備與材料按附錄B執(zhí)行。采樣方法8涂抹法和斑貼法：按本標(biāo)準(zhǔn)“”執(zhí)行?？捎眉?xì)菌總數(shù)檢測后剩余的樣品檢測大腸紙片法：用無菌生理鹽水濕潤大腸菌群快速測定紙片(5cm×5cm)分別貼于采樣處，約檢驗方法按執(zhí)行。5.1每次采樣前應(yīng)對現(xiàn)場采樣人員進(jìn)行工作前培訓(xùn).其內(nèi)容包括采樣目的，計劃安排、采樣技5.2采樣都必須在無菌條件下操作。采樣用具(如采樣器、試管、廣口瓶、剪子等)必須經(jīng)過5.3現(xiàn)場采樣前，熟悉儀器性能及適用范圍，確保5.4采樣前對采樣器流量和其他儀器都應(yīng)該校準(zhǔn)或標(biāo)化處理。校正流量時必須使用現(xiàn)場采樣吸5.6采集空氣細(xì)菌總數(shù)樣品時應(yīng)避開人流通風(fēng)道和通風(fēng)口，并距離墻壁1m遠(yuǎn)。6.2采樣時認(rèn)真填寫“樣品采集記錄表”,采樣記錄的編號應(yīng)與樣品編號一致。采樣后應(yīng)立即貼上標(biāo)簽，每件樣品必需標(biāo)記或登記名稱、來源、數(shù)量、采樣地點、采樣人及采樣年月日。6.3樣品應(yīng)在4h內(nèi)送實驗室，為防止在運輸過程中樣品的損失或污染，存放樣品的器具必須6.4送檢時要認(rèn)真填寫“衛(wèi)生監(jiān)測樣品送檢單”、樣品交接單，連同樣品一并交實驗室，以供9高壓蒸汽滅菌器，干熱滅菌器，恒溫培養(yǎng)箱，冰箱，平皿(直徑9cm)。A.1.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A.1.2.2制法將上述各成分混合，加熱溶解，校正PH至7.4,過濾分裝，121℃20min高壓滅菌。用自然沉降法測定時，傾注約15ml于滅菌平皿內(nèi)，制成營養(yǎng)瓊脂平板。撞擊法參照A.2檢驗公共場所茶具、毛巾、床上臥具、浴盆、臉(腳)盆的設(shè)備與材料高壓蒸汽滅菌器，天平，干熱滅菌箱，滅菌平皿：直徑9cm。培養(yǎng)箱36±1℃。滅菌刻度吸制法：溶解后，分裝到試管內(nèi)，每管10ml,121℃,20min高壓滅菌。另分裝125ml/瓶、供浴盆采樣使用，50ml/瓶，供臉(腳)盆采樣。(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)B.1檢驗公共場所茶具、毛巾、床上臥具、理發(fā)用具、浴盆、臉(腳)盆大腸菌群的設(shè)備與B.1.2檢驗浴盆，臉(腳)盆的儀器與設(shè)備無菌濾紙片，顯微鏡，酒精燈、恒溫箱，旋渦振蕩器、載玻片，冰箱(0～4℃)。平皿(φ90mm),試管架。天平(1/千),吸管，三角燒瓶或廣口瓶(容量125mL或250mL)倒管，0.04%溴甲酚紫水溶液0.65%美藍(lán)溶液制法：將蛋白胨、磷酸鹽水瓊脂溶解于蒸餾水中，調(diào)PH7.1.分裝燒瓶內(nèi)。121℃高壓滅菌15min備用，臨用時加入乳糖并加熱溶化涼脂，冷至50～55℃,加入伊紅和美藍(lán)溶液.搖乳糖0.04%澳甲酚紫水溶液∵115℃高壓滅菌15min,加入指示劑，分裝帶有倒管試管，每管3ml,結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液碘將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至95%乙醇將涂片在火焰上周定，滴加結(jié)晶紫染色液.染lmin,水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗，滴加95%乙醇脫色，約30S,水洗。滴加復(fù)染液，復(fù)染1min,水洗，待干，鏡檢。質(zhì)量要求：紙片必須符合食(飲)具用大腸菌群快速檢驗紙片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，每張紙片Scm×Scm,PH值7.0~7.4,包裝無菌，生產(chǎn)廠家經(jīng)衛(wèi)生部門審核認(rèn)可。顯微鏡，培養(yǎng)箱，離心機(jī)，滅菌吸管，滅菌試管，載玻片，酒清燈，革蘭氏染色用有關(guān)器成分：胰酪胨(或胰蛋白胨)植物蛋白胨(或大豆蛋白胨)磷酸氫二鉀2.5g蒸餾水1000ml制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)PH為7.2～7.3,分裝，121℃,20min高壓滅制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)PH為7.4,分裝，121℃,15min高壓滅菌。C.蒸餾水950g增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50ml與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10ml混合，保存于冰制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃校正PH。分每瓶95ml,121℃高壓滅菌15min,臨用時加熱熔化瓊脂，待冷至50℃加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5ml,搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48h。脫纖維羊血(或兔血)10ml制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱溶化，待冷至50℃左右以無菌手續(xù)加入脫纖維羊血，搖勻，制成平氯化鈉5gg牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12ml制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)PH7.4,加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，115℃,20min高壓滅菌備用。C.1.2.6兔(人)血漿制備取3.8%檸蒙酸鈉溶液，115℃,30min高壓滅菌