慢病毒包裝原理介紹定稿版

慢病毒包裝原理介紹慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應(yīng)用毒包裝簡介及其用途慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導的轉(zhuǎn)錄就Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達~21ntRNA和~50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stemloop)。在siRNA表達載體中，構(gòu)成siRNA的正義與達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA)，載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子轉(zhuǎn)細胞株的篩選；和4~5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個U3'進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNAsiRNA后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達慢病毒載體(Lentiviralvector)較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA，因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供NA質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝的cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒達。、慢病毒載體介紹慢病毒載體(Lentiviralvector,LVs)是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因(或RNAi)導入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)i慢病毒載體介導的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合獻研究表明，慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視毒載體的第2次注射。毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復雜，除gag、pol和env這3個和單純逆uV。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將HIV21基因組中的順式作用元端重復序列)和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統(tǒng)包裝成分由HIV21基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復制能力的病毒LTRSVpolyA成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上，即一個表達粒表達系統(tǒng)包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。其中包裝質(zhì)粒在CMV啟動子vpu質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白(VSV2G)，應(yīng)用VSV2G包膜的假速350bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因或標志基因(綠色熒光蛋白GFP)。將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機會大大減少，減少載體RCV通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，超速離心后病毒滴度可ml四質(zhì)粒表達系統(tǒng)gagpol的轉(zhuǎn)運需要rev，因此，在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)構(gòu)建成四質(zhì)粒表達系統(tǒng)，該系