工業(yè)第六章 高產(chǎn)突變育種具體步驟

一、試述高產(chǎn)突變株誘變選育的一般步驟及每步的目的及注意事項(xiàng)。步驟：1、選擇出發(fā)菌種。（1）、對一般出發(fā)菌株的要求：a、從自然界樣品中分離篩選出來的野生菌株，雖然產(chǎn)量較低，但對誘變因素敏感，變異幅度大，正突變高；b、在生產(chǎn)中使用的，具有一定生產(chǎn)能力，并且在生產(chǎn)過程中經(jīng)過自然選育的菌株；c、采用具有有利性狀的菌株，如生長速度快、營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株；d、由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會提高對其他誘變因素的敏感性，故有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株；e、采用一類被稱為“增變菌株”的變異菌株，它們對誘變劑的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株；f、在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮至少能累計(jì)少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。（2）、選擇具備一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作為出發(fā)菌株。（3）、選擇純種作為出發(fā)菌株。（4）、選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性。目的：根據(jù)需要選擇出發(fā)菌種，要盡量符合育種所需要的生物學(xué)和代謝的特性。2、對出發(fā)菌種進(jìn)行純化、培養(yǎng)等操作，獲得培養(yǎng)液。（1）、確定誘變出發(fā)菌株之后，就要進(jìn)行純化。因?yàn)槲⑸锶菀装l(fā)生變異和染菌。誘變育種工作中，一般采用3—4個(gè)出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。（2）、通過前培養(yǎng)（同步培養(yǎng)）和密集培養(yǎng)制得出發(fā)菌種的培養(yǎng)液。目的：同步培養(yǎng)物在誘變劑處理時(shí)，群體中變化一致，而且細(xì)胞內(nèi)應(yīng)具有豐富的內(nèi)源性堿基。3、單抱子（或單細(xì)胞）懸液的制備。（1）、供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯。（2）、菌懸液制備方法如下：a、細(xì)菌，最好在誘變處理前進(jìn)行搖瓶振蕩預(yù)培養(yǎng)；b、產(chǎn)孢子的菌類進(jìn)行誘變，處理的材料是孢子，而不是菌絲，因?yàn)殒咦右话闶菃魏说模ㄈ缜嗝购秃谇梗z是多核的。c、不產(chǎn)孢子的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理。有三種方法：第一，菌絲尖端法。第二，處理單菌落周圍尖端菌絲。第三，混合處理法。此法常用于化學(xué)誘變劑。目的：制備單孢子（或單細(xì)胞）的懸液，為下一步誘變處理做準(zhǔn)備。4、誘變處理及后培養(yǎng)。（1）、誘變劑種類的選擇。a、選擇誘變劑：誘變劑主要對DNA分子上基因的某一位點(diǎn)發(fā)生作用。根據(jù)誘變劑作用機(jī)制，再結(jié)合菌種特性來考慮選擇哪種誘變劑進(jìn)行誘變。b、根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑：對遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株最好采

用以前未使用過的、突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理，使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，造成大的變異，然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理；對遺傳性不穩(wěn)定的出發(fā)菌株（它們的遺傳背景是復(fù)雜的）首先進(jìn)行自然分離，劃分菌落類型，從中選擇效價(jià)高的、性能好的一類菌落作為誘變處繼續(xù)處理，使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生微小突變，從中篩選突變體。并結(jié)合自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類型不斷增加，成為正常型菌落。c、參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來選擇誘變劑：誘變之前要考查出發(fā)菌株的誘變系譜，詳細(xì)分析、總結(jié)規(guī)律性。為了成功地選育具有某種特性的生產(chǎn)菌種，就要選擇一種最佳的誘變劑。對此，事先需要做預(yù)備實(shí)驗(yàn)，可采用生產(chǎn)能力分類法來直接比較其效果。通常做法是：取幾種誘變劑，各取不同劑量做一系列誘變試驗(yàn)，挑選處理后的菌落上千個(gè)，進(jìn)行生產(chǎn)能力的測定，作出生產(chǎn)能力分布狀況。然后分別統(tǒng)計(jì)它們的正突變株、負(fù)突變株和穩(wěn)定株的頻率。（2）、最適誘變劑量的選擇。a、高產(chǎn)菌株在低劑量時(shí)效果較好，而對多核細(xì)胞、孢子、低產(chǎn)菌株或質(zhì)量性狀處理劑量不宜過低。b、經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理來激活；一次較高劑量的強(qiáng)誘變后，通常接著進(jìn)行2~3次較低劑量的溫和誘變，以利于菌株遺傳性狀的穩(wěn)定。c、在一次誘變中，可以分別采用不同劑量處理出發(fā)菌株，從中選出最佳劑量。d、誘變劑量的控制方法：化學(xué)誘變劑：誘變劑的濃度、處理時(shí)間和處理?xiàng)l件；物理誘變劑：照射距離、照射時(shí)間和照射條件。如下圖：（3）、誘變劑的處理方式。a、單一誘變劑處理。復(fù)合處理：兩種或兩種以上誘變劑同時(shí)處理、不同的誘變劑交替處理、同一誘變劑連續(xù)處理以及紫外線與光復(fù)活交替處理等。b、誘變育種中，誘變處理的方式有多種，常用的有下面幾種方式：直接處理：在緩沖液或無菌生理鹽水體系中對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，然后涂平板分離突變株；生長過程處理：在搖瓶培養(yǎng)基或固體平板中加入誘變劑，在菌體生長時(shí)進(jìn)行誘變處理。（4）、影響突變率的因素。4、菌種遺傳特性不同。^菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

c、環(huán)境條件的影響：誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)；溫度、pH、氧氣等外界

條件對誘變效應(yīng)的影響；平皿密度效應(yīng)。（5）、對誘變菌進(jìn)行后培養(yǎng)，將誘變處理過的細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行

培養(yǎng)，使突變基因穩(wěn)定、純合并表達(dá)，消除表型延遲。目的：通過對誘變劑和誘變劑用量的控制，育出高產(chǎn)突變株。5、突變株的分離與篩選。（1）、常規(guī)篩選程序：誘變初篩■+?挑選菌.落—?2001藏株如株復(fù)涂第一代.：出發(fā)菌株分離到平皿上（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等？——。—-■T-t-（提供第二代誘變出發(fā)菌株）誘變挑菌落f個(gè)菌落MO個(gè)菌落初篩第二代：出發(fā)房株4株——妤離到平nn上（有時(shí)還結(jié)合指示劑呈色劑或底物等）?T個(gè)菌落1100個(gè)菌落—k50株一?3—5株*卷供第三代誘變出發(fā)菌株株）第三代、第四代直到迭育到符合要求的優(yōu)良菌株。（2）、簡便篩選程序：誘變第一代:：出發(fā)菌株離在平皿上丁瓊脂塊菌落1000-3000檢定板上挑取透明圈、初嬸復(fù)篩、成色圈V抑菌圈大的菌落30-50株_5株（提供第二代1—W瓶.?株3—5瓶株誘變的出發(fā)菌株）：第二傳:誘變出發(fā)菌株4株高在平皿上時(shí)丁瓊脂塊菌落1000-3000第二傳:誘變出發(fā)菌株4株高在平皿上時(shí)丁瓊脂塊菌落1000-3000個(gè)菌株檢定板上挑取諼明圈、成色息初篩的菌落30—50株翔篩株。提供第三代誘變的出發(fā)菌株9第三代、第四代…直到迭肓到符合要求的優(yōu)良菌株"（3）篩選的類型：a、隨機(jī)篩選：主要是隨機(jī)挑選的平板菌落進(jìn)行搖瓶篩選。b、平板菌落預(yù)篩：大量菌落經(jīng)過平板預(yù)篩，可保留5%—10%的初篩菌株（約200株），再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，復(fù)證被篩選菌株的重演性，同時(shí)從200株優(yōu)良菌株中篩選出更高產(chǎn)量的突變株。如根據(jù)形態(tài)篩選變株；根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株；采用冷敏感菌篩選抗生素變株；濃度梯度法；應(yīng)用復(fù)印技術(shù)快速篩選變株；瓊脂塊大通量篩選變株。（4）、搖瓶液體培養(yǎng)、產(chǎn)物活性測定及搖瓶數(shù)據(jù)的調(diào)整和有關(guān)菌株特性的觀察及分析。目的：篩選高產(chǎn)突變株。注意事項(xiàng)：1、安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操作中應(yīng)時(shí)刻注意安全問題：個(gè)人安全和環(huán)境安全。（1）、個(gè)人安全：操作時(shí)注意防護(hù)，不同誘變劑要求不同防護(hù)方法，如Y-射線輻射防護(hù)要求較高，uv要求較低，而化學(xué)誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸；（2）、環(huán)境安全：所用物品要經(jīng)解毒處理；液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放。2、工作習(xí)慣：要養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣：如仔細(xì)觀察細(xì)微的形態(tài)變化、要詳實(shí)記錄菌株的誘變史和誘變譜系。誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合。誘變育種由于其篩選的盲目性，突變的不定向性，工作量十分大，因此要對整個(gè)工作進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率。二、試述營養(yǎng)缺陷型突變株選育一般步驟及每步的目的及注意事項(xiàng)。營養(yǎng)缺陷型突變株：營養(yǎng)缺陷型是一種生化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。遺傳信息的載體是一系列為酶蛋白編碼的核酸序列，如果核酸序列中的某堿基發(fā)生突變，由該基因所控制的酶合成受阻，該菌株也因此不能合成某種營養(yǎng)因子，使正常代謝失去平衡。野生型（wildtype）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，均稱該微生物的野生型。原養(yǎng)型（prototroph）:營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的、其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同的菌株。1、營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)。營養(yǎng)缺陷型的誘變方法和所用的誘變因子與普通誘變育種基本相同，只是由于營養(yǎng)缺陷型屬于單一基因突變，各種誘變劑的功能不同，有的不宜作為營養(yǎng)缺陷型誘變劑。目的：通過特定的誘變處理，使其中核苷酸中的堿基發(fā)生改變，變?yōu)橥I養(yǎng)缺陷型突變株。、淘汰野生型菌株。原理：限制營養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長受抑制，野生型細(xì)胞在生長過程中被殺死或生長后被除去。方法：差別殺菌：利用芽孢或孢子比營養(yǎng)細(xì)胞更耐熱的特點(diǎn)。將誘變處理的細(xì)菌形成芽孢，把芽孢在基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后加熱殺死營養(yǎng)體。由于野生型芽孢能萌發(fā)所以被殺死，而營養(yǎng)缺陷型不能萌發(fā)不被殺死。（1）、抗生素法：常用于細(xì)菌和酵母菌營養(yǎng)缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。原理：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖類，而青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚

糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細(xì)胞壁。處在生長繁殖過程的細(xì)菌對青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。（2）、抗生素淘汰野生型的方法和步驟：a、將誘變處理后的菌體用完全培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)2—3代以結(jié)束表型延遲現(xiàn)象，達(dá)到穩(wěn)定的表型和生理狀況。b、饑餓培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后，懸浮于無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6小時(shí)，耗盡細(xì)胞內(nèi)氮源，防止加抗生素后的“誤殺”；c、加抗生素處理：加入等體積的2N基本培養(yǎng)基（兩倍濃度氮源的基本培養(yǎng)基），同時(shí)加入抗生素，培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型細(xì)胞由于生長而被殺死，缺陷型細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)而得以保留。d、取樣分別涂布MM和CM平板，菌落數(shù)差異大的濃縮效果較好。（3）、菌絲過濾法：適用于絲狀真菌。將誘變后的孢子接種至MM中，控制培養(yǎng)時(shí)間，使野生型長成菌絲體，通過過濾而除去菌絲體，反復(fù)幾次后，剩余的多為缺陷型孢子。（4）、饑餓法：該方法用于在某些條件下濃縮雙缺突變株。原理：微生物的某些另一營養(yǎng)缺陷型突變，這一細(xì)胞反而會因代謝平衡的恢復(fù)而避免死亡，從而雙重缺陷型突變株可被濃縮。目的：通過抗生素法、菌絲過濾法及饑餓法除去其中的野生型菌株。3、營養(yǎng)缺陷型的檢出。（1）、限量補(bǔ)充法：MM+0.01%蛋白胨：野生型菌落大，缺陷型菌落小，限量法。如果要篩選特定的營養(yǎng)缺陷型，可以在MM中加入少量的這種單一生此為長因子，此為補(bǔ)充法。（2）、夾層培養(yǎng)法：制備瓊脂平板并培養(yǎng)，長出菌落后作記號，加第四層培養(yǎng)基CM培養(yǎng)，新長出的菌落多為缺陷型。（3）、逐個(gè)檢出法：分離得單菌落，CM點(diǎn)種，逐個(gè)菌落依次點(diǎn)種至MM和CM上培養(yǎng)，在MM上不長、CM上長的菌落為缺陷型。如下圖所示:C.M.M.M.C.M.（4）、影印培養(yǎng)法：分離單菌落CM,用“印章”影印至MM和CM上培養(yǎng)，在MM上不長所對應(yīng)的CM上的菌落即為缺陷型，篩選特定的缺陷型時(shí)，用SM取代CM則可以得到目的菌。如下圖所示:MM目的：除去野生型菌株，檢出營養(yǎng)缺陷型菌株。如下圖所示:MM4、營養(yǎng)缺陷型的鑒定。通過營養(yǎng)缺陷型檢出，僅僅了解突變體屬于營養(yǎng)缺陷型菌株，只有通過鑒別測定，才能確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)缺陷型（如氨基酸類、維生素類、核酸類、碳源或氮源類以及無機(jī)鹽類營養(yǎng)缺陷型等）或更具體的是缺陷哪一種營養(yǎng)因（缺哪種氨基酸或哪種維生素）。（1）、大類的鑒定。用于營養(yǎng)缺陷型測定的氨基酸有21種。用于鑒別缺陷型菌株的維生素約有15種。核酸堿基有7種。方法：缺陷型菌經(jīng)CM液體培養(yǎng)后，離心洗滌，制成107-108個(gè)/ml菌懸液。取0.1ml涂布至MM平板上，分別用無菌小濾片沾取少許各種營養(yǎng)因子后，放入接種的MM上，適宜溫度下培養(yǎng)，（2）、詳細(xì)鑒定。生長因子組合：10種生長因子分成4組，15種分成5組，21種分成6組。將各營養(yǎng)因子等量混合，研細(xì)成粉未；或按照規(guī)定量制成混合液。若氨基酸為DL型，則用量