基因治療一的學習教案

基因治療一的學習教案第1頁/共60頁1972年T.Friedmann和R.Roblin在Science上發(fā)表了題為“基因治療人類的遺傳病（Genetherapyforhumangeneticdisease）”的文章。

但鑒于體外重組技術剛剛問世，人們對“基因治療”尚感到遠不可及，因而未得到學術界的認可。第2頁/共60頁

第3頁/共60頁直到1989年美國NIH的R.M.Blase和W.F.Anderson提出的“基因治療重癥聯(lián)合免疫缺損（SCID）”臨床方案得到批準，并于1990年，他們用腺苷酸脫氨酶(ADA)基因治療了一例ADA基因缺陷導致SCID的4歲女孩Evans，這是世界上第一例基因治療臨床試驗，2年后Evans血液內T細胞的數(shù)量接近正常水平，且ADA基因表達良好，隨之世界各國都掀起了研究基因治療的熱潮，很多遺傳病患者都滿懷信心地接受基因治療。R.M.Blase和W.F.Anderson也被公認為是基因治療的先驅。第4頁/共60頁不幸的是1999年美國發(fā)生了格爾辛基（J.Gelsinger）基因治療副反應事件，美國當即下令暫停所有基因治療的臨床試驗。無獨有偶，法國也發(fā)生了導致患者死亡的“泡泡男孩（bubbleboy）”事件，法國政府也立即終止了該項試驗。使基因治療驟然陷入了困境。經過多年的沉寂后，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，細胞重編程等很多新技術的建立，特別是2007年日本的山中伸彌等成功地將皮膚細胞誘導成多能干細胞后，又點燃了人們對基因治療所寄予的新期盼第5頁/共60頁

第一節(jié)．基因治療的策略一．體細胞基因治療的策略基因治療可分為兩大類:生殖細胞基因治療(germcellgenetherapy)體細胞基因治療(somaticcellgenetherapy)生殖細胞基因治療是將目的基因轉入生殖細胞系中。不僅糾正患者的遺傳缺陷，而且患者的生殖細胞也帶有被校正的基因型。對于小鼠等動物，是可以通過轉基因進行生殖細胞系的治療。第6頁/共60頁(a)受精卵的注射(b)胚系的基因治療(c)體細胞的基因治療轉基因轉基因細胞轉基因注入受精卵中轉基因注入囊胚腔嵌合小鼠嵌合性腺轉基因克隆第7頁/共60頁體細胞基因治療這種方法試圖通過載體，將目的基因轉入某些患者的體細胞中來糾正異常表型。目前，目的基因不可能轉入身體所有的體細胞內。

遺傳病是由于致病基因在一些特定組織中表達的結果。通過從有缺陷基因型的患者體中取出某些細胞，將克隆的野生型基因導入到這些細胞中，再將轉基因的細胞轉入患者體內，為患者提供正常的基因功能。第8頁/共60頁

體細胞基因治療的策略：（1）原位基因修復（insitugenecorrection）：將致病基因的突變位點加以矯正，使致癥狀得到完全恢復。（2）基因置換(genereplacement)：用外源野生型基因原位替換病變細胞內的致病基因，來糾正突變基因的功能，使細胞內的DNA完全恢復正常狀態(tài)。（3）基因激活(geneactivation)

：有些正?；虿荒鼙磉_并非發(fā)生了基因突變，而是由于被錯誤地甲基化或編碼區(qū)組蛋白去乙?；拢灰灿械氖蔷幋a區(qū)正常，但調控區(qū)發(fā)生了突變，如啟動子的突變使基因也無法表達。前者可以通過去甲基化或乙?；够蚧謴突钚?；后者可以加入正常啟動子來激活基因。第9頁/共60頁(4)基因增效(geneaugmentation)：將目的基因導入病變細胞或其它細胞，目的基因的表達產物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強。(5)基因干擾

：也稱基因失活，有兩種干擾方法：

①抑制有害基因：導入抑癌基因（TSG)來抑制癌基因的異常表達，但不能恢復癌基因的正常功能；②

封閉有害基因：用反義RNA或小分子抑制RNA(siRNA)

來封閉癌基因基因，同樣不能恢復癌基因的正常功能，但可用來抑制病原體的關鍵基因。(6)

免疫調節(jié)：將抗體、抗原或細胞因子的基因導入患者體內，改變患者免疫狀態(tài)，達到預防和治療疾病的目的。(7)

藥物敏感療法：應用藥物敏感基因轉染腫瘤細胞，以提高其對藥物的敏感性。第10頁/共60頁二、基因治療的關鍵步驟基因治療的關鍵包括以下三個方面：①目的基因的選擇；②靶細胞的選擇；③選擇安全而高效的方法和載體系統(tǒng)；用于基因治療的基因需滿足以下幾點;①在體內僅有少量的表達就可顯著改善癥狀；②該基因的過度表達不會對機體造成危害；③外源野生型目的基因具有適宜的受體細胞并能在體外有效表達；④具有安全有效的轉移載體和方法，以及可供利用的動物模型。第11頁/共60頁第12頁/共60頁

三、基因治療的靶細胞選擇

目前基因治療中尚不能使用生殖細胞作為靶細胞，而只能使用體細胞。選擇靶細胞須考慮：①最好為組織特異性細胞；②細胞易獲得，具有增殖優(yōu)勢，生命周期長，能存活幾個月至幾年；③離體細胞較易受外源基因轉化；④細胞堅固，能耐受處理，回植到體內易成活。目前常用的靶細胞有：

造血細胞、上皮細胞、角質細胞、內皮細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內皮細胞、淋巴細胞、肌肉細胞、腫瘤細胞等。第13頁/共60頁

四、體細胞基因治療的途徑目前體細胞基因治療的策略可分為兩種：（1）間接體內法，即先體外后體內(exvivo)的方法（2）直接體內（invivo）法。先體外后體內就是將靶細胞由患者體內取出，于體外完成基因轉移后再回輸?shù)交颊唧w內，此種方法的優(yōu)點為靶細胞明確、轉染效率高；直接體內是將目的基因插入載體，經修飾后直接注入患者某特定組織中。此方法轉染效率低，但較前者簡便、費用低，對于某些疾病，如重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)的基因治療效果是較好的。第14頁/共60頁（一）

體外基因治療或exvivo基因治療：（1）從患者體內取出帶有缺陷基因的細胞，并培養(yǎng)；（2）將帶有目的基因的載體通過轉染或感染轉移，到培養(yǎng)的靶細胞中，進行遺傳修正；（3）對遺傳修正的細胞進行選擇和培養(yǎng)；（4）處理過的細胞用融合或移植的方法轉入患者體內。第15頁/共60頁組注射織全身注入質粒DNA基因槍DNA脂質體重組病毒體內基因治療第16頁/共60頁成纖維細胞體細胞

先體外后體內基因治療第17頁/共60頁（二）

體內基因治療

將具有治療功能的基因直接轉入病人某特定組織中。（1）利用反轉錄病毒載體時，要求靶細胞處在分裂期，但許多需進行基因治療的組織多處于靜止期。（2）目前用溫和病毒載體（腺病毒和單純性皰疹病毒）直接注入相應的組織。第18頁/共60頁第二節(jié)基因轉移的方法

基因轉運的方法目前已有多種，總的可分為非生物方法和病毒方法兩大類。前者包括裸露DNA直接注射、多價陽離子-DNA復合物轉化，電轉化，脂質體共轉化和受體介導的轉化等。后者指通過攜帶目的基因的病毒感染靶細胞并表達出目的基因的方法。第19頁/共60頁

一、基因轉移的非生物方法

理化方法介導的基因轉移（非病毒載體）是目前發(fā)展較快的新型載體系統(tǒng)，其優(yōu)點是低毒和低免疫反應。其攜帶的外源基因的載體常獨立存在細胞質中，不整合到宿主基因組中。非病毒載體一般不受基因插入片斷大小的限制，還有使用簡單、獲得方便、便于保存和檢測等特點。目前常用的方法有以下幾種：第20頁/共60頁（一）磷酸鈣共沉淀法當將氯化鈣，DNA和PBS（phosphate-bufferedsaline）緩慢混合時，即形成磷酸鈣微沉淀。如有培養(yǎng)細胞（須先用氯化鈣處理）存在時，DNA-磷酸鈣沉淀物能附著在細胞膜上，經過內吞作用而進入細胞中。第21頁/共60頁

（二）脂質體介導轉染將磷脂，膽固醇或其他脂類的乙醚溶液注入60℃

DNA水溶液中。乙醚在60℃

時氣化蒸發(fā)，其速度達到2ml/h時即形成單層或雙層的脂質體小泡，其直徑0.2~0.5μm，它將DNA包裹在其中。帶有正電荷的脂質體-DNA復合體很容易和培養(yǎng)基上的細胞融合，使DNA分子進入細胞內。這種簡單的技術由PhilipFelgner等建立的。第22頁/共60頁（三）電穿孔法真核細胞的電穿孔是將細胞重懸浮于含有一定濃度的DNA（約0.1mg/ml）的N-2-

羥乙基哌嗪-N‘-2-乙磺酸（HEPES，N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonate)緩沖鹽溶液中。然后將此懸浮細胞-DNA放到一個特殊的電穿孔小槽中，小槽設有正、負電極與電源相連接。第23頁/共60頁（四）

直接注射法：(1)將含有外源DNA的溶液直接注入肌肉

或甲狀腺等可引起鄰近的細胞攝入DNA和目的基因表達的產物。(2)重組DNA可貯存于5％～30％的蔗糖溶液中，也可溶在生理鹽水或PBS（磷酸緩沖液）中以備注射。第24頁/共60頁（五）

微粒子轟擊法：用高能微粒子轟擊，將外源DNA導入培養(yǎng)細胞或活的哺乳動物組織內，在貼壁細胞、懸浮細胞、活體組織中均能很好表達。亞微粒的鎢和金能自發(fā)吸附DNA。用這種方法基因可在多種組織中表達。第25頁/共60頁（六）受體介導的基因轉移質粒DNA和某種特異配體之間形成復合體，而這種配體能被特定細胞的表面受體所識別。使外源基因可在活體內導向特定的細胞、組織或器官。但用受體介導時所形成的內吞小泡通常要被送到溶酶體中，可使此小泡的內溶物被降解。然而通過完整的腺病毒誘導小泡破裂，可使內含的DNA序列保持完整，使其表達的絕對量顯著提高。第26頁/共60頁一般采用配體＋多聚賴氨酸（PL＋DNA）的策略，如用脫唾液酸蛋白（asialoglyco-protein，ASGP）作為配體與PL連接可將反義RNA帶到肝中，這是因為肝細胞上有ASGP相應的受體。第27頁/共60頁受體介導方法的優(yōu)點：（1）是無感染能力；（2）可特異性轉染靶細胞；（3）理論上不受DNA大小的限制；（4）構建靈活。

缺點：（1）轉染效率低；（2）難以用于體內基因治療；（3）可能有免疫原性；（4）只有短暫表達。第28頁/共60頁

二、基因轉移的病毒方法

多數(shù)病毒可感染特異的細胞，在細胞內不易降解RNA病毒能整合到染色體上；其基因表達水平較高等。目前已被用作載體的病毒有：

反轉錄病毒、

腺病毒、

腺病毒相關病毒、

單純性皰疹病毒和

肝炎病毒等。第29頁/共60頁（一）反轉錄病毒載體1．反轉錄病毒(retrovirus)屬于正鏈RNA病毒，特點是：（1）可感染分裂細胞；（2）可整合到宿主染色體中；（3）表達時間較長。最廣泛使用的又是Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。第30頁/共60頁反轉錄病毒基因組大約10kb，含有三個最重要的基因：gag（編碼核心蛋白）、pol（編碼反轉錄酶）和env（編碼病毒外膜蛋白）。兩端存在LTR用于介導病毒的整合。

LTRgagpolenvLTR第31頁/共60頁第32頁/共60頁第33頁/共60頁反轉錄病毒載體的優(yōu)點是：（1）基因組小并且簡單，能穩(wěn)定地整合到宿主基因組的隨機位點上；（2）能高效地感染宿主細胞，可將遺傳信息傳遞給大量受體細胞，細胞感染率可達

100％；（3）侵染范圍廣，可侵染不同生物和細胞；（4）原病毒較穩(wěn)定，且拷貝數(shù)低；（5）對宿主細胞無毒副作用；（6）可包裝10kb外源DNA。第34頁/共60頁缺點是：（1）僅整合到處于分裂狀態(tài)的細胞；（2）一些反轉錄病毒中存在原癌基因，其會引起癌變的發(fā)生；（3）反轉錄病毒的LTR可致使細胞癌變；（4）常常只有短暫表達；（5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有限，不能插入較大的基因。第35頁/共60頁2．構建重組反轉錄病毒載體構建反轉錄病毒載體多來源于鼠白血病病毒（Mo-MLV），此類病毒為嗜雙性病毒，既可感染鼠細胞亦可感染人細胞。反轉錄病毒載體的基本成份包括：（1）病毒基因組分，如LTR、病毒的包裝識別信號、翻譯所需的剪接識別位點及poly（A）尾等；（2）高效的治療基因如抑癌基因、自殺基因等：（3）標記基因，用于篩選；（4）其它質粒必要成分，如復制起始區(qū)。

第36頁/共60頁反轉錄病毒用作載體時需進行幾步改造：（1）基本原則是用標記基因和外源基因替代病毒的編碼基因。（2）制備包裝細胞系，為載體DNA提供其喪失的功能。（3）將載體DNA導入包裝細胞系以產生病毒載體。（4）病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內得以表達。

第37頁/共60頁gag

Ψ+LTRpolenvLTR人類基因Ψ+LTRLTRneor5'5'3'3'用一個或多個外源基因來置換病毒基因組中的gag,pol和env

基因。此病毒載體能以不同的方式插入到細胞的染色體中。在此例中,用供選擇的標記基因（neor）置換了病毒的gag

和pol

基因，而用一個人類的基因置換了env基因。第38頁/共60頁第39頁/共60頁5'-LTRLTR-3'

?Ψgagpolenv

?Ψ包裝細胞系RNA

Ψ

-RNA

基因組編碼病毒蛋白的RNA

病毒蛋白

不產生病毒顆粒

gag

ΔΨLTRpolenvLTR5'3'助病毒插入到培養(yǎng)的細胞中

細胞質

細胞核

第40頁/共60頁用非生物學方法或轉染技術將重組DNA插入到培養(yǎng)的包裝細胞系中，由于載體提供了包裝信號Ψ+

，載體的RNA基因組能被包裝。細胞內的助病毒中所合成的衣殼蛋白自動包裝成病毒顆粒，然后被包裝細胞釋放出來。但載體病毒只能感染，而不能再產生病毒顆粒，因為它沒有gag、pol和env基因。第41頁/共60頁用載體病毒感染靶細胞(如人類的骨髓細胞)，載體病毒整合到靶細胞DNA中，形成前病毒。其基因隨著基因組一道轉錄，整合的目的基因合成特定的蛋白質。第42頁/共60頁

反轉錄病毒載體可分為以下幾類：①雙表達載體：在載體中插入兩個外源基因分別取代gag，

pol和

env。外源基因的表達受到5'LTR調控序列的控制。②內部啟動子載體（IPvector）：在載體中插入兩個外源基因，由5'LTR調控；③自失活載體（pSIN）：前兩種載體的LTR作為啟動子有可能激活原癌基因。同時5'LTR啟動子和外源基因的啟動子可能會相互影響。為了克服以上缺點，人們構建了自失活載體。即刪除5'LTR啟動子，這樣反轉錄時破壞了兩端的LTR區(qū)的模板，消除了LTR的潛在致癌作用。第43頁/共60頁

反轉錄表達載體提供了一個基因轉移有效方法，使克隆基因在適當?shù)乃拗骷毎械玫奖磉_。通過脂質體介導，用重組的Ψ+反轉錄載體穩(wěn)定轉染Ψ-

包裝細胞系能建立非復制的重組體反轉錄病毒庫。重組體反轉錄載體基因組的轉錄產生感染病毒的產物，通過細胞膜釋放到培養(yǎng)基中?；謴透叩味戎亟M體反轉錄病毒庫被用來感染宿主靶細胞，在細胞內重組體RNA基因組通過含在病毒衣殼中的反轉錄酶反轉錄成雙鏈cDNA。反轉錄病毒的表達系統(tǒng)能被用來進行DNA的轉移和穩(wěn)定轉染

。第44頁/共60頁（二）腺病毒（Adv）載體腺病毒載體中腺病毒基因組上的E1A（使原代細胞永生化）和E1B基因（導致全面轉化）已被目的基因所取代，因而在體內普通細胞中缺乏復制能力；僅在染色體上已整合有E1A和E1B的包裝細胞（如293細胞）中，復制缺陷型的重組腺病毒才能包裝成完整的腺病毒顆粒。最優(yōu)化的腺病毒載體的特點。圖示腺病毒載體含有包裝序列和ITR以及最低限度的腺病毒基因的組序列。第45頁/共60頁

腺病毒生物學特性：腺病毒DNA是36kb線性分子，兩端各有一個50bp反向末端重復區(qū)（ITR），ITR

內側為病毒包裝信號。基因組上分布著四個早期轉錄區(qū)（E1、E2、E3、E4），和一個晚期轉錄區(qū)（負責結構蛋白的編碼）。重復序列（103～162bp)，其中含有復制起點和包裝信號。E2，E4區(qū)編碼復制蛋白；E3區(qū)和細胞免疫有關。第46頁/共60頁第47頁/共60頁第48頁/共60頁

腺病毒載體的制備（1）先構建含有E1(負責包裝)或E3（和細胞免疫有關）區(qū)兩側序列的質粒；（2）將外源基因插入E1或E3區(qū)，并保持轉錄方向一致；（3）與腺病毒基因組中也含有E1或E3區(qū)某一側序列的片斷共轉染細胞，在細胞中通過重組后挑取空斑，得到重組載體。第49頁/共60頁

E1區(qū)E1區(qū)第50頁/共60頁第一個DNA分子(即所謂穿梭載體，shuttlevector)含有腺病毒左側的反向末端重復序列（LITR）、腺病毒包裝信號(ψ)等順式作用元件以及目的基因表達盒和腺病毒基因組的左端一段序列；另一個DNA分子（即骨架載體，backbonevector）與第一個DNA分子的3′端略微重疊，然后繼續(xù)向右，包含有大部分的病毒基因組序列。兩種DNA分子共轉染入可以表達腺病毒E1區(qū)蛋白的細胞（如293、911以及PERC6等），并發(fā)生同源重組，即可得到預期的復制缺陷型重組腺病毒。第51頁/共60頁

腺病毒載體優(yōu)點：（1）易于制備、培養(yǎng)、純化和濃縮；（2）基因組大，因而可插入大片段外源基因；（3）可高效地（體外實驗通常接近100%轉導效率）轉導不同類型的人組織細胞；（4）可轉導非分裂細胞；（5）在細胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產量；（6）進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而安全性較高；（7）可在呼吸道和腸道中繁殖，因此不僅可通過靜脈注射進行基因治療，而且還可以通過口服、噴霧、氣管滴注等簡單易行的方法進行基因治療。第52頁/共60頁

缺點：

（1）表達外源基因時間短，不能滿足基因治療的需要。如需長期表達需反復注射。（2）免疫原性強，可引發(fā)機體產生強烈的炎癥反應和免疫反應；（3）重組、純化費時；（4）幾乎可以感染所有細胞，而缺乏特異性。第53頁/共60頁第一代腺病毒載體為E1或E3基因缺失，缺失區(qū)插入外源治療基因。但此類型載體可引發(fā)機體產生強烈的炎癥反應和免疫反應，且表達外源基因時間短。第二代腺病毒載體則另外讓E2a或E4基因缺失，則產生較弱的免疫反應，其載體容量和安全性方面亦改進許多。第三代腺病毒載體缺失了全部的（無內容病毒載體，gutlessviralvector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體，mini-Ad），僅保留ITR和包裝信號序列。最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表達引起的細胞免疫反應進一步減