基因組注釋的學(xué)習(xí)資料

基因組注釋的學(xué)習(xí)資料第1頁/共54頁5.1搜尋基因5.1.1根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特征搜尋基因5.1.2同源基因查詢5.1.3實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因第2頁/共54頁5.1.1根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特征搜尋基因通過ORF掃描（ORFscanning)定位蛋白質(zhì)編碼基因

“Anopenreadingframeisaportionofagene'ssequencethatcontainsasequenceofbases,uninterruptedbystopsequences,thatcouldpotentiallyencodeaprotein”

第3頁/共54頁i)原核生物中ORF掃描可有效定位基因

原核生物的ORF是指從起始密碼子到終止密碼子的一段序列，通常代表一個編碼蛋白質(zhì)的基因

startcodon:ATGstopcondon:TAA,TAG,TGA

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ORF掃描的關(guān)鍵是stopcodon在6種讀框中出現(xiàn)的頻率，一般長的ORF（不少于100個codon)可能代表一個基因（Ecoli~317codonsyeast~483human~450）原核生物基因無內(nèi)含子，基因間DNA少，很少有重疊基因和基因內(nèi)基因，因此原核生物中簡單的ORF掃描可以定位大多數(shù)基因第5頁/共54頁ii)真核生物ORF掃描程序的修改不能僅僅根據(jù)ORF長度來判斷哪種讀框正確，因?yàn)椋?/p>

a.基因間有大量的非編碼序列

b.基因通常含有非編碼的內(nèi)含子，外顯子長度往往小于100個密碼子掃描真核生物ORF必須加入的規(guī)則：

①密碼子偏倚（codonbias)②外顯子-內(nèi)含子邊界（exon-intronboundaries)③上游調(diào)控序列（upstreamregulatorysequence)

第6頁/共54頁Codonbias:是指特定生物體的基因中并不是所有密碼子的使用頻率都是相同的所有生物都有密碼子偏倚，預(yù)期真正的外顯子有密碼子偏倚，而非編碼區(qū)，三聯(lián)核苷酸隨機(jī)排列不會有密碼偏倚現(xiàn)象，只有平均的堿基分布水平。所以根據(jù)已有的生物密碼子偏倚的資料在編寫計(jì)算機(jī)程序時會寫入這些限制，許多基因注釋程序會寫明適用于哪些物種第7頁/共54頁人類，果蠅和大腸桿菌中精氨酸密碼使用頻率的比較第8頁/共54頁Exon-intronboundaries

內(nèi)含子5’端或donorsite:5’-AG↓GTAAGT-3’3’端或acceptorsite:5’-PyPyPyPyPyPyCAG-3’很多外顯子-內(nèi)含子邊界序列并不是上述序列，所以上述序列只適用于一定范圍第9頁/共54頁Upstreamregulatorysequence

調(diào)控序列有明顯特點(diǎn)，在查找基因時可作為參考，特別是原核生物，但真核生物基因上游的調(diào)控序列變化較大，以此作為標(biāo)志判斷基因應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎另外個別生物的基因組特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有CpG島第10頁/共54頁定位功能性RNA（functionalRNA)基因

此類RNA往往具有特征性的二級結(jié)構(gòu)，這些特征可以用來幫助在基因組序列發(fā)現(xiàn)它們第11頁/共54頁5.1.2同源基因搜索同源查詢（homologysearch)

通過待查基因組序列與DNA數(shù)據(jù)庫中的已知基因序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基序列或蛋白質(zhì)序列及其比例用于界定基因的方法依據(jù)現(xiàn)有生物的不同種屬之間具有功能或結(jié)構(gòu)相似的同源基因成員，它們在起源上一脈相承，其間存在保守的順序組成第12頁/共54頁5.1.2同源基因搜索同源查詢（homologysearch)

通過待查基因組序列與DNA數(shù)據(jù)庫中的已知基因序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基序列或蛋白質(zhì)序列及其比例用于界定基因的方法依據(jù)現(xiàn)有生物的不同種屬之間具有功能或結(jié)構(gòu)相似的同源基因成員，它們在起源上一脈相承，其間存在保守的順序組成第13頁/共54頁序列相似性的表現(xiàn)：

①存在某些完全相同的序列②ORF讀框的排列類似，如等長的外顯子③ORF指令的氨基酸順序相同④模擬的多肽高級結(jié)構(gòu)相似第14頁/共54頁比較基因組學(xué)是一種更準(zhǔn)確的同源搜尋方法運(yùn)用基因組之間的同線性可以檢測短ORF的真實(shí)性第15頁/共54頁常用的基因注釋軟件1)abinitio基因預(yù)測軟件GeneScan

(/GENSCAN.html)偏重于運(yùn)用起始密碼子，終止密碼，終止信號，剪接供體和受體序列，多聚嘧啶序列，分支點(diǎn)保守序列來進(jìn)行基因預(yù)測

FgeneSH

(/berry.phtml)

偏重于運(yùn)用密碼子使用偏好來進(jìn)行基因預(yù)測,據(jù)研究是最快和最準(zhǔn)確的預(yù)測基因的軟件第16頁/共54頁2）根據(jù)同源性進(jìn)行基因注釋

TWINSCAN

（/nscan）

SGP2

（http://genome.crg.es/software/sgp2/sgp2.html)任何一種軟件都不可能根據(jù)所有的特征來編寫，所以實(shí)際的基因組注釋中一般是綜合好幾種軟件程序的結(jié)果，以及搜索cDNA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果等等，最后將信息整合到計(jì)算機(jī)上，就顯示出不同程序而確定的不同序列特征的位置第17頁/共54頁典型基因組注釋系統(tǒng)所顯示的內(nèi)容第18頁/共54頁5.1.3實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因依據(jù)是任何基因都可轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝Northernblotting可以判斷DNA序列是否含有表達(dá)序列第19頁/共54頁種屬間雜交/動物園雜交（zoo-blotting)

對Northern雜交不易檢測到的基因可以采用此法親緣關(guān)系相近的物種，基因編碼區(qū)相似性高，非編碼區(qū)同源性低，因此將某一物種的DNA順序與來自另一親緣種的DNA片段進(jìn)行Southern雜交，如果產(chǎn)生陽性信號，則該區(qū)段可能含有基因第20頁/共54頁Zoo-blotting第21頁/共54頁獲得基因在基因組中的定位信息的最容易的方法是對相關(guān)cDNA進(jìn)行測序

比較cDNA與基因組DNA序列，可以找到基因的位置以及外顯子和內(nèi)含子的邊界

要獲得單個cDNA，首先需要構(gòu)建cDNA文庫，然后用目的基因DNA片段篩選文庫

對于不完整的cDNA,可根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)引物，通過RACE技術(shù)得到基因的全長cDNA序列第22頁/共54頁5’RACE(rapidamplificationofcDNAends)第23頁/共54頁3'RACE第24頁/共54頁5.2確定單個基因功能5.2.1計(jì)算機(jī)預(yù)測基因功能5.2.2用實(shí)驗(yàn)分析闡明基因功能5.2.3其他的基因功能研究方法第25頁/共54頁5.2確定單個基因功能5.2.1計(jì)算機(jī)預(yù)測基因功能主要依據(jù)仍然是同源性比較，同源基因可分為兩種：直向同源基因（orthologousgene/orthlog）:不同物種間的同源基因，來自物種分隔前的同一祖先，結(jié)構(gòu)相似，功能高度保守乃至于幾乎相同橫向同源基因（paralogousgene/paralog):同一物種內(nèi)的同源基因，通常是多基因家族的不同成員，由基因復(fù)制并趨異產(chǎn)生，共同的祖先可能存在物種形成之前或者之后第26頁/共54頁第27頁/共54頁同源性、一致性和相似性

homology:指起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的基因成員，同源性只有“是”和“非”的區(qū)別，沒有百分比的說法

identity:指同源DNA順序的同一堿基位置的相同的堿基成員,或者蛋白質(zhì)的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成員,可用百分比表示

similarity:同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例

一般認(rèn)為氨基酸的一致性或相似性大于25%可視為同源基因第28頁/共54頁兩個DNA序列具有80%的序列一致性當(dāng)在氨基酸序列比較時，兩個序列之間缺少同源性就更明顯（nt76%，aa28%）第29頁/共54頁同源性比較最常用的軟件程序是BLAST，此程序能鑒別相似性大于30%-40%的同源基因有相同的結(jié)構(gòu)域的非同源基因，可以通過在已知基因中結(jié)構(gòu)域的功能推測未知基因的功能第30頁/共54頁5.2.2用實(shí)驗(yàn)分析闡明基因功能

通過基因失活進(jìn)行功能分析

1）基因剔除（geneknock-out)定義：通過同源重組，一段無關(guān)的DNA片段取代某一特定的基因，使其失去功能的技術(shù)原理：在一段無關(guān)片段的兩側(cè)連接與替換基因兩側(cè)相同的順序，將這一構(gòu)件導(dǎo)入目的細(xì)胞，由于同源片段之間的重組，可以使無關(guān)片段取代靶基因整合到染色體中。為了便于篩選,用于取代的外源DNA中含有報告基因第31頁/共54頁2023/3/1432第一階段構(gòu)建帶有中斷基因的干細(xì)胞第32頁/共54頁2023/3/1433第二階段將中斷基因置于動物體內(nèi)第33頁/共54頁2）轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（transposontagging）

通過向基因中插入轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子使基因失活人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座第34頁/共54頁3）RNA干擾（RNAinterference)

利用雙鏈小RNA高效，特異地降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷靶基因表達(dá)，引起基因表達(dá)沉默第35頁/共54頁5.2.2用實(shí)驗(yàn)分析闡明基因功能

基因過表達(dá)用于功能檢測通過增加基因的拷貝數(shù)和采用強(qiáng)啟動子促使基因超表達(dá)，使受體表現(xiàn)出生長和發(fā)育的異常，來研究基因的功能第36頁/共54頁Activationtagging2023/3/1437第37頁/共54頁5.2.2用實(shí)驗(yàn)分析闡明基因功能其他的基因功能研究方法基因失活與過量表達(dá)是研究基因功能的基本方法，但并非只有這兩種技術(shù)才能提供基因功能的信息有許多蛋白質(zhì)必須與其他蛋白質(zhì)互作才能表現(xiàn)其功能,常用的研究蛋白質(zhì)互作的技術(shù)：

噬菌體外顯(phagedisplay)，酵母雙雜交(yeasttwohybridsystem)第38頁/共54頁Y2H基本原理2023/3/1439第39頁/共54頁Y2H基本過程第40頁/共54頁P(yáng)hagedisplay第41頁/共54頁P(yáng)hagedisplay第42頁/共54頁5.3功能基因組學(xué)5.3.1轉(zhuǎn)錄組研究基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）；通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度（abundance）第43頁/共54頁第44頁/共54頁第45頁/共54頁數(shù)字基因表達(dá)譜分析

（digitalgeneexpressionprofiling）第46頁/共54頁基因芯片技術(shù)

通過微加工技術(shù)，將大量特定序列的DNA片段（基因探針，probe)分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品(sample)分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息第47頁/共54頁2023/3/1448第48頁/共5