PCR臨床應(yīng)用資料

PCR臨床應(yīng)用資料第1頁(yè)/共70頁(yè)P(yáng)CR與基因診斷技術(shù)基因診斷即通過(guò)核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病作出診斷的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面開展，1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國(guó)應(yīng)用于臨床檢測(cè)。第2頁(yè)/共70頁(yè)4基因診斷3

免疫學(xué)診斷臨床診斷細(xì)胞膜細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)1形態(tài)學(xué)診斷2

生化診斷概念第3頁(yè)/共70頁(yè)基本原理

以DNA為例（1）DNA變性：（2）降溫退火：（3）引物延伸：第4頁(yè)/共70頁(yè)原理第一步–

加熱變性預(yù)處理第5頁(yè)/共70頁(yè)第二步–

引物與靶序列退火

第6頁(yè)/共70頁(yè)第三步-引物延伸

第7頁(yè)/共70頁(yè)第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列

PCRPCR.exe動(dòng)畫第8頁(yè)/共70頁(yè)30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量

No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824第9頁(yè)/共70頁(yè)熒光PCR的原理第10頁(yè)/共70頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)的特點(diǎn)

靈敏度高特異性強(qiáng)快速簡(jiǎn)便

應(yīng)用范圍廣第11頁(yè)/共70頁(yè)Ct值的意義Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增FQ-PCRCt值與濃度不同的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同第12頁(yè)/共70頁(yè)感染性疾病的診斷母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學(xué)鑒定熒光定量PCR的臨床應(yīng)用第13頁(yè)/共70頁(yè)早期診斷病情評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)新藥驗(yàn)證第14頁(yè)/共70頁(yè)一感染性疾病

1.病原體含量與病情之間的關(guān)系

2.病原體含量與用藥之間的關(guān)系

3.藥物及療法的研究與開發(fā)

4.新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn)

5.新的愈后指標(biāo)

6.傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測(cè)與預(yù)防臨床應(yīng)用第15頁(yè)/共70頁(yè)臨床應(yīng)用二腫瘤1.腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體等2.腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因第16頁(yè)/共70頁(yè)三遺傳病1.等位基因檢測(cè)2.多基因遺傳病的突變檢測(cè)3.基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測(cè)第17頁(yè)/共70頁(yè)1.親子鑒定

2.法醫(yī)物證

3.PCR-RFLP技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

4.罪犯鑒定法醫(yī)鑒定第18頁(yè)/共70頁(yè)免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在較長(zhǎng)的“窗口期”，不利于對(duì)疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測(cè)病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷。疾病的早期診斷第19頁(yè)/共70頁(yè)熒光定量PCR在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用一肝炎病毒定量檢測(cè)二性病病原體檢測(cè)三結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測(cè)四優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)臨床應(yīng)用第20頁(yè)/共70頁(yè)肝炎病毒定量檢測(cè)HBVHCV臨床應(yīng)用第21頁(yè)/共70頁(yè)（一）乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好HBV第22頁(yè)/共70頁(yè)HBV（二）HBV-DNA與“兩對(duì)半”1.“兩對(duì)半”：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2.“攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測(cè)的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。第23頁(yè)/共70頁(yè)3.血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。

HBV（二）HBV-DNA與“兩對(duì)半”HBsAg(－)

HBV-DNA(＋)

HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗體陽(yáng)性與HBVDNA2.5×103copy/ml結(jié)果解釋。第24頁(yè)/共70頁(yè)HBV(三)

HBV-DNA定量檢測(cè)的臨床意義3.HBV-DNA定量與預(yù)后

a.含量高者急性肝炎患者易慢性化

b.癌變的幾率明顯高于含量低者1.HBV-DNA定量與HBV復(fù)制水平及傳染性2.HBV-DNA定量與乙肝藥物療效

a.專家提出<103copy/ml做為陰性或臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)b.HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后)c.拉咪呋啶第25頁(yè)/共70頁(yè)HBV(三)

HBV-DNA定量檢測(cè)的臨床意義4.HBV-DNA定量有助于指導(dǎo)懷孕與孕期，哺乳期檢查5.肝臟移植與HBV-DNAMazzaferro等報(bào)告：<103copy/ml無(wú)一例再發(fā)肝炎

>105copy/ml發(fā)生了嚴(yán)重HBV再感染6.血液制品和獻(xiàn)血員的篩選第26頁(yè)/共70頁(yè)HBVDNA檢測(cè)的臨床意義HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBVDNA可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎第27頁(yè)/共70頁(yè)病毒特點(diǎn)：

1.單正鏈RNA病毒

2.E1和E2區(qū)基因高度變異性（一）丙型肝炎病毒特點(diǎn)HCV感染特點(diǎn)：HCV在血中含量極微輸血后肝炎主要致病因子免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV，非中和抗體，產(chǎn)生時(shí)間不一有一部分人感染HCV后，不產(chǎn)生抗-HCV感染易于慢性化(50-85%)疫苗研制尚不成功單鏈RNA第28頁(yè)/共70頁(yè)(二)

HCV-RNA定量檢測(cè)的臨床意義

1.早期診斷

a.臨床以<80copy/ml做為無(wú)感染或治愈標(biāo)準(zhǔn)。

b.HCV感染1-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。

c.嚴(yán)格篩選獻(xiàn)血員,提高對(duì)窗口期感染者的檢出率。

HCV第29頁(yè)/共70頁(yè)HCV(二)

HCV-RNA定量檢測(cè)的臨床意義2.HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性。

抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。3.HCV-RNA是評(píng)價(jià)抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。4.慢性丙型肝炎長(zhǎng)期抗-HCV陽(yáng)性，這時(shí)如果進(jìn)行HCV-RNA

定量檢測(cè)可以鑒別活動(dòng)性、復(fù)制程度。第30頁(yè)/共70頁(yè)二常見性傳播疾病病原體一淋球菌（NGH）二沙眼衣原體（CT）三解脲脲原體（UU）四梅毒螺旋體（TP）五單純庖疹病毒（HSV）六乳頭瘤病毒（HPV）七人類免疫缺陷病毒（HIV）STD第31頁(yè)/共70頁(yè)NGH淋球菌感染與致病1.人是淋球菌的惟一宿主。2.發(fā)病率最高，在所STD疾病中，高達(dá)60%左右。3.發(fā)病趨勢(shì)：

a.男性多于女性。

b.城市走向農(nóng)村，

c.高收入階層向低收入階層擴(kuò)展4.人對(duì)淋球菌感染無(wú)天然抵抗力，免疫不持久，再感染和慢性患者普遍存在。5.如母親為淋病患者，嬰兒出生時(shí)易患上淋球菌性結(jié)膜炎第32頁(yè)/共70頁(yè)CT沙眼衣原體感染與致病1.嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生。2.不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要病原體。3.近年來(lái)在歐美等國(guó)，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過(guò)淋球菌而居STD之首。4.在我國(guó)，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。5.泌尿生殖道感染，妨礙妊娠。6.盆腔感染，可致生殖能力損害。第33頁(yè)/共70頁(yè)UU解脲脲原體感染與致病合成尿素酶，分解尿素2.在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原體感染，居第二位。3.流產(chǎn)超過(guò)4次以上者，檢出率高達(dá)80%。4.有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。5.與男性不育相關(guān)。男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達(dá)66.6％。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動(dòng)力下降而升高。第34頁(yè)/共70頁(yè)1.非培養(yǎng)或形態(tài)學(xué)檢查的診斷技術(shù)，快速、特異、敏感。2.對(duì)無(wú)癥狀或癥狀輕者，可以早期確診。3.對(duì)NGH、CT、UU等混合感染者，診斷和鑒別診斷。4.指導(dǎo)用藥、考核療效。

熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義NGH/CT/UU第35頁(yè)/共70頁(yè)NGH/CT/UU熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義5.不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。6.流行病學(xué)調(diào)查，為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據(jù)。第36頁(yè)/共70頁(yè)CT、UU、NGH、HPV、TP除NGH可培養(yǎng)外，其余難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)。即使能培養(yǎng)，所需時(shí)間長(zhǎng)—48小時(shí)↑。第37頁(yè)/共70頁(yè)人乳頭瘤病毒感染與致病1.HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞，人是HPV的惟一宿主。2.有100多個(gè)型。3.低危型：HPV6、11引起良性病變(尖銳濕疣、喉乳頭瘤等)HPV第38頁(yè)/共70頁(yè)人乳頭瘤病毒感染與致病HPV4.高危型：HPV16、18引起惡性腫瘤(宮頸癌、肛門癌、口腔癌等)5.免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。6.新生兒產(chǎn)道感染。第39頁(yè)/共70頁(yè)看看這些英年早逝的藝人，她們死于宮頸癌……宮頸癌的知曉率在不斷提高。梅艷芳(40歲)國(guó)家一級(jí)演員李媛媛(41歲)第40頁(yè)/共70頁(yè)HPV第41頁(yè)/共70頁(yè)1.對(duì)典型病例可以明確診斷。2.對(duì)臨床表現(xiàn)和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。3.對(duì)亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。4.基因分型。5.考核療效與預(yù)后。6.病毒載量與患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。HPV熒光定量PCR檢測(cè)HPV的意義第42頁(yè)/共70頁(yè)HPV第43頁(yè)/共70頁(yè)三結(jié)核桿菌與呼吸道病原體檢測(cè)TB：TuberclebacilliCP：ChlamydiapneumoniaMP：MycoplasmalpneumoniaSARS：severeacuterespiratorysyndrome第44頁(yè)/共70頁(yè)結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（1）羅伯特·科赫（１８４３——１９１０），德國(guó)細(xì)菌學(xué)家，結(jié)核桿菌發(fā)現(xiàn)者結(jié)核病是一個(gè)全球性的問題，近年來(lái)在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行，且呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)TB第45頁(yè)/共70頁(yè)結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀（2）我國(guó)結(jié)核病的疫情僅次于印度而居世界第二位2000年，全國(guó)人口結(jié)核感染率為44.5%，其中15～44歲人群占了53％，每年約有25萬(wàn)人死于結(jié)核病第46頁(yè)/共70頁(yè)結(jié)核桿菌引起的感染肺部感染：原發(fā)性肺結(jié)核，開放性肺結(jié)核。肺外感染：腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖結(jié)核、腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎、全身性結(jié)核。第47頁(yè)/共70頁(yè)常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽(yáng)性率低、費(fèi)時(shí)2.細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(zhǎng)(3-4W)3.血清學(xué)診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽(yáng)性

b.不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性不能早期診斷！容易漏診、誤診！TB第48頁(yè)/共70頁(yè)熒光定量PCR檢測(cè)TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測(cè)10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)2.早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結(jié)核病TB第49頁(yè)/共70頁(yè)3.熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽(yáng)性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對(duì)藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)TB熒光定量PCR檢測(cè)TB-DNA的意義第50頁(yè)/共70頁(yè)四TORCH感染特點(diǎn)與檢測(cè)TOX:Toxoplasma

gondiiRV:Rubellavirus

CMV:HumancytomegalovirusHSV:HerpessimplexvirusTORCH第51頁(yè)/共70頁(yè)TORCH感染特點(diǎn)

1.母-胎傳播的主要病原體

2.引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因

3.自然狀態(tài)下呈隱性感染

4.懷孕、多次輸血、AIDS等易發(fā)生顯性感染

5.可致多發(fā)性、全身性感染

6.只有風(fēng)疹可獲得長(zhǎng)久的免疫力，可用疫苗預(yù)防

TORCH第52頁(yè)/共70頁(yè)(一)弓形蟲感染與致病滋養(yǎng)體如弓形，廣泛分布，人獸共患。寄生在有核細(xì)胞中，貓和貓科動(dòng)物是終宿主易感者多，免疫者少我國(guó)智力低下兒的弓形蟲感染率28％畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽(yáng)性率12.25％艾滋病患者約有20％～80％合并弓形蟲感染，造成艾滋病死亡的一個(gè)重要并發(fā)病TORCH–TOX第53頁(yè)/共70頁(yè)人群自然感染率達(dá)到60-90%，多為隱性感染免疫功能低下(懷孕、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染可發(fā)生垂直傳播，是宮內(nèi)感染和胎兒畸形的主要病毒之一圍生期感染血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可檢出病毒(二)人巨細(xì)胞病毒感染與致病TORCH-CMV第54頁(yè)/共70頁(yè)風(fēng)疹是一種世界性的病毒傳染病，是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一出疹前1周至出疹后5天均有傳染性人是風(fēng)疹病毒的唯一宿主風(fēng)疹感染后可獲得持久的免疫力，臨床顯性再感染并不多見。(三)人風(fēng)疹病毒感染與致病TORCH-RV第55頁(yè)/共70頁(yè)先天性風(fēng)疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時(shí)，可致先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS)三聯(lián)癥：白內(nèi)障、耳聾、心臟病。妊娠時(shí)體內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素的增加以及細(xì)胞免疫功能的減弱，這種對(duì)正常人無(wú)害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。TORCH-RV(三)人風(fēng)疹病毒感染與致病第56頁(yè)/共70頁(yè)HSV原發(fā)感染多為隱性，大多無(wú)臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn)HSV-1主要引起口唇皰疹，皰疹性結(jié)膜炎、腦炎，皮膚性皰疹HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹

(80%)。HSV感染后大多數(shù)個(gè)體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復(fù)發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長(zhǎng)期存在宿主體內(nèi)。TORCH-HSV(四)

人單純皰疹病毒感染與致病第57頁(yè)/共70頁(yè)妊娠期婦女因HSV-1被激活，可通過(guò)胎盤感染胎兒，引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。圍產(chǎn)期感染可引發(fā)新生兒皰疹，死亡率高達(dá)50%以上。HSV常與HIV-1同時(shí)感染，并能促進(jìn)病情發(fā)展，引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復(fù)制與宮頸癌關(guān)系密切。TORCH-HSV(四)

人單純皰疹病毒感染與致病第58頁(yè)/共70頁(yè)常規(guī)TORCH檢測(cè)方法與不足組織培養(yǎng)或病原體分離：慢，費(fèi)力，陽(yáng)性率低。血清學(xué)診斷：

IgG：人群自然感染率高達(dá)60-90%。

IgG(＋)不能區(qū)別既住感染與現(xiàn)癥感染；新生兒IgG(＋)不能說(shuō)明有感染。

IgM：IgM(＋)可能是原發(fā)性感染；

IgM(－)不能排除感染。TORCH局限性：1.不能定量分析

2.抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響

3.交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性第59頁(yè)/共70頁(yè)熒光探針檢測(cè)TORCH的優(yōu)勢(shì)原理：直接檢測(cè)TORCH病原體的核酸優(yōu)點(diǎn)：靈敏、快速，特異意義：早期診斷，婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育

1.篩選TORCH患者，提高出生人口素質(zhì)。

2.有利于預(yù)測(cè)胎兒宮內(nèi)感染狀況及妊娠結(jié)局。3.TORCH感染孕婦的治療效果觀察。

4.器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人監(jiān)控。

5.建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)

TORCH第60頁(yè)/共70頁(yè)TORCH

TOXCMVRVHSV核測(cè)核酸DNADNARNADNA檢測(cè)標(biāo)本血液、羊水、絨毛膜血液、尿液、乳汁、唾液、精液、分泌物咽拭子、血液、尿液、羊水、胎盤、妊娠物皰疹液、患處刮片、粘膜、血液TORCH檢測(cè)核酸與檢測(cè)標(biāo)本的比較第61頁(yè)/共70頁(yè)檢驗(yàn)結(jié)果解析HBV--DNA定量結(jié)果定量測(cè)定，測(cè)定的