生物電子顯微術第一章課件

生物電子顯微術3/14/20231生物電子顯微術1緒論基本概念EM發(fā)展史EM分類及特點電鏡技術的應用各種顯微鏡性能與特點的比較2電子顯微鏡的基本知識TEM的結構和原理SEM的結構和原理3/14/202323超薄切片技術基本概念普通超薄切片技術4負染色技術5金屬投影和復型技術金屬投影技術復型技術6EM冷凍制樣技術概述冷凍超薄切片技術冷凍斷裂(蝕刻)及復型技術冷凍安全規(guī)則3/14/202339X-ray顯微分析X-ray微區(qū)分析的基本原理X-ray顯微分析儀工作的基本原理X-ray顯微分析的方法及應用10其他顯微技術掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡掃描電-聲顯微鏡3/14/20235生物電子顯微術課時安排講授：30學時實驗：10學時主要內容：電鏡的原理、結構（TEM，SEM）電鏡的樣品制備技術1)超薄切片技術4)金屬投影及復型技術2)負染色技術5)SEM制樣技術3)冷凍制樣技術6)其他制樣技術應用舉例3/14/20236主要參考文獻生物電子顯微術張景強中山大學出版實用生物電子顯微術林鈞安遼寧科技出版生物電子顯微術教程陳力北師大出版電子顯微鏡與電子光學黃蘭友科學出版生物醫(yī)學電子顯微技術程時北醫(yī)、協(xié)和生物學工作者實用生物電子顯微術[英}

G．Ａ．ＭＥＥＫ1976

參考文獻1，2，3圖書館均有3/14/202372．電子顯微術：以電子顯微鏡為工具，對物質（樣品）進行物理、化學、成分、超微結構等方面研究的一種技術。

電子顯微術定義:

電子顯微學是凝聚態(tài)物理、材料科學、乃至生命科學的交叉學科，是物質科學研究的一個重要組成部分。它是以電子顯微學等方法,在原子尺度上對物質的微觀結構進行研究分析,從而促進了新物質、新結構、新性能、新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，極大地推動了新材料、新器件的發(fā)展。

3/14/202393．超微結構：指一般光學顯微鏡不能分辨的細微形態(tài)結構（亞顯微結構），直至生物大分子結構（蛋白質、核酸、多糖、脂類）。4．電子顯微方法：ElectronMicroscopy指利用電子與固體樣品作用時所發(fā)出的信息，對樣品進行微區(qū)觀察和分析的一種方法。1mm=103μm1μm=103nm1nm=10?1?=10-10m3/14/2023101.2電子顯微鏡的發(fā)展概況光學顯微鏡的發(fā)展(LM:lightmicroscope)光鏡的誕生人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的兩點之間的最短距離．用“”表示．13世紀玻璃的發(fā)明制造眼鏡、放大鏡16世紀歐洲放大鏡=0.01M=3~30倍1590年荷蘭眼鏡商Hans之子---Janssen裝配具有劃時代意義的“顯微鏡”1665年英國物理學家RobertHook(虎克)第一臺光學顯微鏡1675年荷蘭Leeuwen.Hook(列文.賀克M=270倍,共研制247臺光鏡高倍率的光鏡18世紀到19世紀中葉英、法、意相繼研制消色差顯微鏡M=1500~2000人的視力提高了1000多倍0.2μm3/14/202311表1-1電磁波各光譜區(qū)的一些參數(shù)及相應的結構分析方法

3/14/202313可見光波長4000~8000?

opt=0.4*光紫外線波長=3900~130?紫外線顯微鏡opt=1000?X-ray=100~0.5?但無法偏轉不能成像目前,光鏡最好分辨率opt=0.16~0.32μm結論:

利用波長的更短光線做照明光源,可提高分辨率。（OR：波長越短，分辨率越高）

電子波波長很短易于成像，從而導致電鏡的產(chǎn)生和發(fā)展3/14/202314電鏡的發(fā)展國外情況電鏡產(chǎn)生的三大理論基礎

Thomson（1897）證明電子的存在

L.de.Broglie(德.1923)提出微觀粒子的波粒二相性

H.Busch(德.1926)建立幾何電子光學理論電子的存在19世紀50年代德.波恩Geissler

3/14/202315幾何電子光學理論電子光學：指研究和利用電子流的偏轉、聚焦、成像規(guī)律的一門學科。1925年，柏林工學院M.knoll和A.Matthias嘗試做聚焦的電子束透鏡1926年，H.Busch帶有鐵軛的短磁透鏡聚焦理論D.gabor(M.knoll的學生）包殼透鏡(1948年提出全息技術全息技術之父并獲諾貝爾獎)1928-1929,Ernst.Ruska極靴磁透鏡,現(xiàn)代磁透鏡透射電鏡的誕生1932年，M.Knoll和他的學生E.Ruska發(fā)明了電鏡,放大倍數(shù)16倍;改進后75Kv,1.2萬倍1939年,西門子制造第一臺商品透射電鏡1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌體,建立第一個開放實驗室1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer獲得諾貝爾物理獎3/14/202317掃描電鏡的誕生1935年，M.knoll設計第一臺SEM1956年，二次電子探測器出現(xiàn)1956年，SEM商品化國內情況校外狀況TEM1953年，長春光機所第一臺XD-100型100kvTEM1965年，中科院科儀廠DX-2型TEM100kv5?1970年，上海新躍儀表廠DXB1_12型TEM40萬1977年，上海新躍DXB2_12型TEM80萬2?SEM1975年，中科院科儀廠第一臺SEMDX-3100?DX-560?

1980年，中科儀KYKY-1000B1993年，中科儀KYKY-2000KYKY-2800 KYKY-2800BKYKY-38003/14/202318STM(scanningtunnelingmicroscope)1987年，中科儀、中科院化學所白春禮等研制第一臺STMSSX-1型國產(chǎn)電鏡的缺點：

制造工藝粗燥、自動化程度低、清潔度差我校情況1980‘sDX-2型TEM1996年，KYKY-2800型數(shù)字式掃描電鏡分辨率6nm，放大倍數(shù)10萬3/14/202319樣品制備簡單，可觀察較大的樣品分辨率高，30~40

?倍率連續(xù)可變，從4倍~~15萬倍可配附件，進行微區(qū)的定量、定性分析觀察對象：樣品表面微觀結構掃描透射電鏡（STEM）兼顧SEM/TEM的特點、造價高、可觀察較厚樣品(0.2~04m)分辨率不如TEM高,高分辨型0.3~0.5nm;附件型1.5~3nm在200KV時，輻射損傷小、污染小能過檢測到掃描透射電子，獲取更多超微結構信息圖像的反差和亮度易調節(jié)，切片可以不染色顯像方式：熒光屏、顯像管觀察對象：表面、內部3/14/202321超高壓電鏡（UHVEM:ultra-highvoltageelectronmicroscope）HV<500kv為高壓電鏡,一般TEM：120~500KVHV>500kv為超高壓電鏡，Hvmax=3MV

其特點：穿透能力強、可觀察較厚的樣品μm級分辨率高，2

?（晶格分辨率）單色性好，色差小，成像質量好輻射損傷小體積龐大、結構復雜、價格昂貴、需專用的防護裝置觀察對象：主要非生物材料的晶格結構、觀察細胞骨架系統(tǒng)（微梁、微絲）3/14/202322分析電鏡（AEM:analysiselectronelectronmicroscope)

連續(xù)X-ray背底扣除能量：Z特征X-ray的能量

特征X-ray

波長：Z特征X-ray的波長波譜儀（WDS）Wavelength-dispersespectrometer

微區(qū)定量分析，4Be92U慢20~60分，靈敏度高能譜儀（EDS）Energy-dispersespectrometer

微區(qū)定性分析，11Na92U快2~3分，靈敏度低3/14/202323優(yōu)點：可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷。這些特點適用于研究生物樣品和在不同試驗條件下對樣品表面的評價，例如對于多相催化機理、超導機制、電化學反應過程中電極表面變化的監(jiān)測等。STM在生物領域的應用：STM在生物和有機材料一領域有著廣泛的應用前景。盡管目前還存在著如何解釋生物樣品的STM圖象、如何更好地制備生物樣品以及選擇合適襯底以沉積生物分子等問題，但實際應用中已取得了不少好結果。例如在真空、大氣和溶液條件下的DNA研究，球蛋白、膠原蛋白及紅血球的研究等。STM在納米科技中的應用：

STM不僅能夠對樣品表面進行成像，而且還能在納米尺度上對材料表面進行刻蝕與修飾。由微觀到宏觀，即直接操縱單個原子和分子，對它們進行排列組合，以形成新的物質，或制造出一定功能的機器這是實現(xiàn)納米加工的新思想，STM的出現(xiàn)使這一思想變?yōu)楝F(xiàn)實。自從STM問世以來，STM作為一種納米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻寫、電子束誘導沉積以及單原子操縱等方面，并取得了一批高水平的研究結果。3/14/202325硅111面7′7原子重構象

硅片是大家熟悉的制作晶體管和大規(guī)模集成電路的半導體材料，為了得到表面清潔的單質材料，要對硅片進行高溫加熱和退火處理，在加熱和退火處理的過程中硅表面的原子進行重新組合，結構發(fā)生較大變化，這就是所謂的重構。

3/14/202326科學家把碳60分子每十個一組放在銅的表面組成了世界上最小的算盤。與普通算盤不同的是，算珠不是用細桿穿起來，而是沿著銅表面的原子臺階排列的.3/14/202329這是中國科學院化學所的科技人員利用納米加工技術在石墨表面通過搬遷碳原子而繪制出的世界上最小的中國地圖。3/14/202330DNA分子拉成的DNA圖象3/14/202331原子力顯微鏡（AFM：atomicforcemicroscope)導電樣品、非導電樣品均可觀察分辨率達到原子水平可以在真空、超高真空、電化學環(huán)境、常溫低溫條件下工作應用于表面科學、生命科學、材料科學

注：以STM、AFM為基礎，衍生出掃描探針顯微鏡（SPM：Scanningprobemicroscope）：如激光力顯微鏡（LFM）、掃描電化學顯微鏡（SECM）3/14/202332環(huán)境掃描電鏡（ESEM）特點：多種真空狀態(tài)：高、低、超低真空

1Torr=1mmHg柱壓力=1/760大氣壓=133.3Pa

粗真空：760~10乇低真空：10~10-3乇 高真空：10-3~10-8乇超高真空：10-8乇以下多種真空條件下可得SE像、BE像，且

=4nm樣品室可充氣體:水氣、氮氣動態(tài)分析：樣品溫度從-185℃~1000℃制樣簡單：樣品無須鍍膜、脫水干燥真正的“環(huán)境”條件，可直接觀察含水、含油樣品缺點：造價太高$30萬Philips低氣壓空間3/14/2023331.4電鏡技術的應用生物科學方面：細胞生物學分子生物學動物學和植物學微生物學醫(yī)學科學基礎醫(yī)學臨床醫(yī)學農(nóng)林畜牧科學植物保護良種繁育（遺傳育種）土壤改良與成分分析動植物疾病的快速診斷與防治3/14/202334Ⅳ材料科學機械部件的疲勞、失效分析金屬金相學建筑材料分析Ⅴ其他方面：礦產(chǎn)、地質與考古、海關、造紙、電池生產(chǎn)、物理學與化學、環(huán)境保護

3/14/2023351.5各種顯微鏡性能與特點的比較種類LMTEMSEM照明源可見光電子束電子束透鏡玻璃透鏡電子透鏡電子透鏡最高分辨率0.1~0.2μm（紫外顯微鏡）1~2?（晶格）3?（點）4~30~100?

放大倍率1×～2000×100×~80萬7×~20萬焦點深度淺(500倍時2μm)中(500倍時500μm)深(500倍時1000μm)特征表一3/14/202336種類LMTEMSEM視場100mm(1×)2mm(100×)10mm(10×)圖象色彩有無無顯相方式直接觀察熒光屏顯象管樣品種類切片、涂片切片、復型膜,涂片各種實體樣品厚度厚（數(shù)微米）極薄<1000?不限樣品環(huán)境空氣真空真空續(xù)表一特征3/14/202337樹立正確的人類認識觀DM機體器官解剖水平（宏觀）LM細胞細胞水平（微觀）EM亞