醫(yī)學(xué)臨床研究中三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的運(yùn)用,生物技術(shù)論文

醫(yī)學(xué)臨床研究中三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的運(yùn)用,生物技術(shù)論文內(nèi)容摘要：三維細(xì)胞培養(yǎng)(Three-DimensionalCellCulture,TDCC)允許體外腫瘤細(xì)胞在各個方向上生長,能夠在細(xì)胞基因表示出、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動等方面更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)。TDCC既保存體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài),又具體表現(xiàn)出細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性,為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞特征提供了良好的平臺,十分是在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、藥敏研究等關(guān)鍵領(lǐng)域。TDCC將傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)與動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖嘟Y(jié)合,取精用宏,為推進(jìn)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)揮舉足輕重的作用。本文著重闡述TDCC技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,包括腫瘤藥理學(xué)、干細(xì)胞和類器官模型的臨床應(yīng)用及生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用,為臨床及基礎(chǔ)研究工作者提供理論根據(jù)與參考。本文關(guān)鍵詞語：三維細(xì)胞培養(yǎng)(TDCC);藥理學(xué);干細(xì)胞;臨床應(yīng)用;細(xì)胞外基質(zhì);DevelopmentofThree-DimensionalCellCultureandItsApplicationinMedicalResearchYUKunZHOUYongchunMolecularDiagnosticCenterofTheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity(YunnanCancerHospital)Abstract：Three-DimensionalCellCulture(TDCC)technologyisatechniquebetweensingle-layercellcultureandanimalexperiments.Itcannotonlysimulatetheinternalenvironmenttothegreatestextent,butalsodemonstratetheintuitivenessandconditionsofcellculture.TDCCnotonlyretainsthemorphologyofcellsinvivo,butalsoembodiesthevisualizationandconditioncontrollabilityofcellculture,whichprovidesagoodplatformforfurtherstudyonthecharacteristicsoftumorcells,especiallyinthekeyfieldsoftransformationmedicine,drugsensitivityresearchandsoon.TDCCcombinesthetraditional2Dcellculturewiththeanimalexperimentalmodel,whichisveryimportantforpromotingthestudyoftumorcellbiology.ThisarticlefocusesontheapplicationofTDCCtechnologyinmedicalresearch,includingoncologypharmacology,clinicalapplicationofstemcellandorganoidmodelandapplicationinlifescienceresearch,aimstoprovidetheoreticalbasisandreferenceforclinicalandbasicresearchworkers.1三維細(xì)胞培養(yǎng)的前世今生細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的萌芽能夠追溯至1885年,德國科學(xué)家WillhelmRoux成功分離雞胚細(xì)胞并用鹽水培養(yǎng)數(shù)日[1,2]。1943年,Earle等開創(chuàng)建立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法,初次開創(chuàng)建立長期傳代的L-細(xì)胞系,五年后,Sanford使用細(xì)胞分離培養(yǎng)法獲純L-細(xì)胞系[3]。隨著雙抗、胰蛋白酶的應(yīng)用,體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)日升月恒,具有易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn),細(xì)胞在很長一段時間內(nèi)能夠無限增殖和分化,但其生長發(fā)育的環(huán)境和條件與體內(nèi)差異較大,這就導(dǎo)致細(xì)胞的基因表示出和形態(tài)特征與體內(nèi)差異較大,得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能逐一在動物體內(nèi)得到重復(fù)。上世紀(jì)80年代,Weaver等對細(xì)胞與ECM間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié),在對乳腺癌細(xì)胞的研究中構(gòu)建出TDCC模型,并觀察到單層管狀腺泡樣構(gòu)造的正常乳腺上皮細(xì)胞及腺泡構(gòu)造的碗狀的癌變上皮細(xì)胞[4],三維培養(yǎng)技術(shù)運(yùn)勢而生,正式登上歷史的舞臺,嶄露頭角。本世紀(jì)初Jacks和Weinberg[5]和Abbott[6]發(fā)表了使用MatrigelTM與海綿凝膠混合基質(zhì)進(jìn)行組織培養(yǎng),構(gòu)成了疑似三維構(gòu)造的細(xì)胞團(tuán)。同年,Amann團(tuán)隊(duì)[7]描繪敘述了使用非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系與肺成纖維細(xì)胞組合的新型3D共培養(yǎng)模型。通過比照研究,證明了該模型更接近體內(nèi)細(xì)胞生長微環(huán)境,能更好地反映腫瘤-基質(zhì)互相作用。Young等[8]總結(jié)了前人的經(jīng)歷體驗(yàn),借組織輥(TRACER)平臺(生成的生物復(fù)合材料卷繞在心軸周圍以產(chǎn)生3D和分層構(gòu)造)將癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)和下咽鱗狀細(xì)胞(FaDu)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),發(fā)如今培養(yǎng)物的24和48h確實(shí)產(chǎn)生了增殖速率和侵襲性細(xì)胞遷移的增加。為研究腫瘤-基質(zhì)互相作用以及新型TDCC形式提供了基礎(chǔ)。近年腫瘤基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中,TDCC技術(shù)已得到越來越多的關(guān)注。2在腫瘤藥理學(xué)研究中的應(yīng)用Souza團(tuán)隊(duì)[9]利用2D和磁性3D生物打印系統(tǒng)培養(yǎng)并用抗腫瘤藥物紫杉醇和多西紫杉醇評估了前列腺腫瘤細(xì)胞系PC-3,LNCaP和DU145的增殖、基因表示出、化學(xué)抗性和細(xì)胞毒性差異,TDCC物顯示出較低的細(xì)胞增殖率,對紫杉醇和多西紫杉醇更大的抗性以及發(fā)生了基因表示出譜的改變。藥物誘導(dǎo)的肝損傷是制藥工業(yè)中與安全相關(guān)的磨損的主要原因。研究者們也在不斷突破肝細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞這些2D肝臟模型的局限性,繼續(xù)尋找更切合體內(nèi)實(shí)際的體外模型。3D肝臟模型的出現(xiàn),包括球狀體,3D生物打印的肝臟和肝臟上芯片,徹底改變了體外肝臟毒性測試。這些模型被統(tǒng)稱為微生理系統(tǒng)(MPS)。該模型能夠在培養(yǎng)物中維持至少1個月,在這里期間保持顯著的藥物代謝能力。一些MPS模型可以以與其他非本質(zhì)支持細(xì)胞共培養(yǎng),例如內(nèi)皮細(xì)胞,庫普弗細(xì)胞和星狀細(xì)胞,這增加了毒性評估模型的多功能性。TDCC表現(xiàn)出與體內(nèi)系統(tǒng)更類似的行為,是新藥研發(fā)最有前途、更為可靠的工具。3干細(xì)胞和類器官模型的臨床應(yīng)用具有廣泛來源和多能分化的人多能干細(xì)胞(hPSCs)被以為是組織修復(fù)和重建領(lǐng)域的后起之秀。然而,傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)改變了hPSCs的初始生長環(huán)境,導(dǎo)致自我分化、衰退、形態(tài)學(xué)甚至基因表示出等改變,三維球體培養(yǎng)在促進(jìn)hPSCs的生物活性中起著重要作用。Nachlas等[10]用透明質(zhì)酸和聚N-異丙基丙烯酰胺組成的熱響應(yīng)性3D水凝膠對hPSCs進(jìn)行培養(yǎng),這種具有調(diào)節(jié)化學(xué)和機(jī)械性質(zhì)能力的系統(tǒng)易于在低溫下與細(xì)胞混合,在37℃時在水凝膠內(nèi)進(jìn)行物理包封,保持細(xì)胞多能性,其分化增殖能力得到加強(qiáng)。Sasagawa團(tuán)隊(duì)[11]試圖使用臍帶血衍生的內(nèi)皮祖細(xì)胞的亞型,具有強(qiáng)烈的增殖和血管生成潛力的內(nèi)皮細(xì)胞集落構(gòu)成細(xì)胞(ECFC)制造血管前體,并評估這些構(gòu)建體的體內(nèi)血管生成潛力。人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)也用于與ECFC比擬,ECFC使用纖維蛋白包被的細(xì)胞片操縱器夾在衍生的成纖維細(xì)胞(FB)片之間。將雙層FB片中插入的ECFC培養(yǎng)3d,導(dǎo)致構(gòu)成與HUVEC類似的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造。另外,當(dāng)ECFC夾在3個FB片材中時,在共培養(yǎng)后3d在3層細(xì)胞片構(gòu)建體中發(fā)現(xiàn)了管腔構(gòu)造。將含有ECFC的這些構(gòu)建體移植到免疫缺陷大鼠的皮下組織中,1周后,與HUVEC陽性移植物一樣的方式觀察含有大鼠紅細(xì)胞的ECFC的功能性微血管,表示清楚ECFC可能成為3D細(xì)胞密集組織構(gòu)建體中制造血管前構(gòu)造的替代細(xì)胞來源而在臨床得到廣泛應(yīng)用。4生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用業(yè)已證實(shí),3D培養(yǎng)的細(xì)胞比二維貼壁細(xì)胞具有更多的生理學(xué)相關(guān)功能。隨著腫瘤與其微環(huán)境之間互相作用的復(fù)雜性變得越來越明顯,迫切需要設(shè)計(jì)能夠真實(shí)地概括3D微環(huán)境和相關(guān)細(xì)胞群的體外模型。細(xì)胞在復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境中被細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)三維包裹,并與ECM和相鄰細(xì)胞互相作用。因而,復(fù)制ECM環(huán)境是細(xì)胞培養(yǎng)模型成功的關(guān)鍵。已有多項(xiàng)研究基于物理、化學(xué)和生物特征(例如生物相容性,生物可降解性和生物化學(xué)官能團(tuán))使用各種天然和合成水凝膠來模擬ECM環(huán)境,由于這些特性,水凝膠可與微流控技術(shù)結(jié)合并在芯片上構(gòu)建3D系統(tǒng),同時可控制所選水凝膠的孔隙率以促進(jìn)營養(yǎng)素和氧氣的移動,近乎完美地模擬了體內(nèi)微環(huán)境[12]。骨肉瘤(OS)是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤,優(yōu)先發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。盡管標(biāo)準(zhǔn)化療在過去幾十年中顯著改善了長期存活率,但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S患者的預(yù)后仍然非常差。因而,需要新的療法來減緩進(jìn)展并鏟除疾病。除此之外,為了更好地理解導(dǎo)致OS發(fā)作和進(jìn)展的細(xì)胞和分子機(jī)制,亟待開發(fā)類似于天然三維腫瘤微環(huán)境的新型培養(yǎng)系統(tǒng)。Angela等[13]總結(jié)了TDCC的最新技術(shù),并報(bào)告所獲得的成果,突出了這些模型在再現(xiàn)腫瘤環(huán)境中的成效,華而不實(shí)建立的3DOS球體模型被以為是腫瘤研究中最具生理學(xué)相關(guān)性的三維模型[14]。然而,由于材料的選擇,制造工藝以及需要同時支持硬組織和軟組織和多種細(xì)胞群的最佳條件,使得骨腫瘤3D建模仍然是一項(xiàng)困難的嘗試。5結(jié)論與瞻望當(dāng)下,TDCC作為一項(xiàng)新興的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),已從單純的懸浮成球演變到微流控、芯片、組織工程支架和3D打印培養(yǎng),無不證明TDCC將在將來臨床醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)研究中起到扮演越來越重要的角色。然而,TDCC尚存一定的局限性:首先,繁瑣的制備步驟及昂貴的成本限制了其推廣;其次,有限的分化程度和生存能力阻礙了TDCC的發(fā)展。因而,我們應(yīng)積極采取措施,(1)用納米技術(shù)等更高層次新的材料和加工技術(shù),讓培養(yǎng)系統(tǒng)的各項(xiàng)參數(shù)可控可調(diào)。(2)與不同類型的生物反響器結(jié)合,如與流式生物反響器結(jié)合,來解決三維培養(yǎng)中代謝產(chǎn)物或者藥物運(yùn)動擴(kuò)散受限的情況;(3)以此為平臺建立多種細(xì)胞共培養(yǎng)體系,如腫瘤細(xì)胞+免疫細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)等,以明確腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)及其他相鄰細(xì)胞之間同時作用的影響。為此,將來TDCC技術(shù)的發(fā)展需要醫(yī)學(xué),生物科學(xué)、材料和高分子化學(xué)、物理學(xué)、儀器制造業(yè)等很多領(lǐng)域的跨學(xué)科協(xié)作發(fā)展,以上這些都將更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞真實(shí)的微環(huán)境情況,有助于我們得出更準(zhǔn)確的科學(xué)結(jié)論,助力精準(zhǔn)醫(yī)療。以下為參考文獻(xiàn)[1]WilhelmRoux.Developmentaltheories1885-1895[J].RouxsArchDevelopBiol,1991,200(6):297-299.[2]HarndenDG.CellBiologyandCellCultureMethods-AReview[M].Dordrecht:SpringerNetherlands,1977:3-15.[3]SanfordKK,EarleWR,LikelyGD.Thegrowthinvitroofsingleisolatedtissuecells[J].JNatlCancerInst,1948,9(3):229-246.[4]WeaverVM,FischerAH,PetersonOW,etal.Theimportanceofthemicroenvironmentinbreastcancerprogression:recapitulationofmammarytumorigenesisusingauniquehumanmammaryepithelialcellmodelandathreedimensionalcultureassay[J].BiochemistryCellBiologybiochimieEtBiologieCellulaire,1996,74(6):833-851.[5]JacksT,WeinbergRA.Takingthestudyofcancercellsurvivaltoanewdimension[J].Cell,2002,111(7):923-925.[6]AbbotA.Biologysnewdimension[J].Nature,2003,424(6951):870-872.[7]AmannA,ZwierzinaM,GamerithG,etal.Developmentofaninnovative3Dcellculturesystemtostudytumour-stromainteractionsinnon-smallcelllungcancercells.[J].PlosOne,2020,9(3):92511.[8]YoungM,RodenhizerD,DeanT,etal.ATRACER3DCo-Culturetumourmodelforheadandneckcancer[J].Biomaterials,2021,164(28):54.[9]SouzaAG,SilvaI,CamposfernandezE,etal.ComparativeAssayof2Dand3DCellCultureModels:Proliferation,GeneExpressionandAnticancerDrugResponse[J].CurrPharmDes,2021,24(15):1426-1427.[10]NachlasA,LiS,JhaR,etal.HumaniPSC-derivedmesenchymalstemcellsmaturedintovalveinterstitiallikecellsusingPEGDAhydrogels.[J].ActaBiomaterialia,2021,36(7):213-216.