布病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)培訓(xùn)安課件

布病病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷

陜西省CDC鼠布生防科·安翠紅布魯氏菌病布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起傳染－變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱布病。布魯氏菌簡(jiǎn)稱為布氏菌。

布病病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)123布氏菌的生物學(xué)特性布氏菌的抗原及毒力布病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

1.1

布氏菌的發(fā)現(xiàn)

1887年英國(guó)軍醫(yī)Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國(guó)士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。

1.1布魯氏菌的分類學(xué)位置

微生物分類學(xué)家將布氏菌歸為布魯氏菌屬（Brucella），下分6個(gè)種19個(gè)生物型。分類羊種布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型；牛種布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型；豬種布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型；沙漠森林鼠種布氏菌（Br.neotemae）；綿羊附睪種布氏菌（Br.ovis）；犬種布氏菌（Br.canis）。1.2形態(tài)和培養(yǎng)特征布氏菌屬的細(xì)菌是一組微小的球桿狀的革蘭氏染色陰性菌?？率先旧?，布氏菌染成紅色，其他菌染成綠色或藍(lán)色。寬0.3～0.6μm，長(zhǎng)0.6～1.5μm。無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、無(wú)質(zhì)粒、不形成莢膜。一般說(shuō)來(lái)，羊種菌最小，牛種菌次之，豬種菌最大。1.2培養(yǎng)特性營(yíng)養(yǎng)條件高，生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)所需溫度為20-40℃，最適溫度為37℃.通常要經(jīng)過(guò)4-6天，有的甚至要經(jīng)過(guò)20-30天（雙相培養(yǎng)基）才能長(zhǎng)出菌落。不同溫度對(duì)布魯氏菌影響對(duì)物理因子的抵抗力布魯氏菌對(duì)消毒劑的抵抗能力對(duì)化學(xué)因子的抵抗力不同環(huán)境中的抵抗能力

布氏菌的抗原、毒力布氏菌的抗原、內(nèi)毒素32.1布氏菌的毒力2.22布氏菌的抗原成分十分復(fù)雜，存在A、M、G成分。A對(duì)牛種布氏菌有特異性，M對(duì)羊種布氏菌有特異性，G為兩種菌共有。還與多種細(xì)菌存在共同抗原，因而有血清交叉反應(yīng)。布氏菌不產(chǎn)生外毒素，只產(chǎn)生內(nèi)毒素，有致熱、致炎作用，可導(dǎo)致休克。布氏菌的抗原及內(nèi)毒素32.1.1從種上來(lái)說(shuō)，羊種毒力最強(qiáng)，豬種和牛種次之，犬種的毒力很弱，幾乎不引起人致病。布氏菌的毒力32.1.2布氏菌實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)3細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)33.1血清學(xué)檢驗(yàn)3.2診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)。3.1.1實(shí)驗(yàn)室要求布氏菌的分離培養(yǎng)要在生物安全二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。布氏菌是高致病性病原微生物，從危害程度來(lái)說(shuō)為第二類病原微生物。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)33.13.1.2方法采樣（采血）雙相培養(yǎng)基菌株鑒定（菌落形態(tài)觀察、涂片、染色、鏡檢布氏菌診斷血清玻片凝集試驗(yàn)）種型鑒定（CO2需要與否、H2S的產(chǎn)生的測(cè)定、染料抑菌試驗(yàn)、單項(xiàng)因子血清凝集試驗(yàn)、噬菌體裂解試驗(yàn)等等）細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)33.1布魯氏菌培養(yǎng)材料3.1.4布氏菌培養(yǎng)檢查材料人或動(dòng)物的全血、動(dòng)物流產(chǎn)胎兒（胎兒的肝臟、肺、胃內(nèi)容物）動(dòng)物臟器、動(dòng)物胎盤、關(guān)節(jié)液、陰道分泌物等新鮮乳汁

布魯氏菌的培養(yǎng)3.1.5樣品的采集血培養(yǎng)：急性期、體溫反應(yīng)明顯和血清滴度高的病人，血培養(yǎng)陽(yáng)性率高血培養(yǎng)陽(yáng)性率與病期、體溫反應(yīng)、臨床表現(xiàn)以及血清滴度等有關(guān)系骨髓培養(yǎng)：慢性期病人骨髓培養(yǎng)的陽(yáng)性率比血液高從胸腔積液、膿腫和關(guān)節(jié)液、痰、乳、陰道分泌物流產(chǎn)胎盤中分離到布氏菌新鮮乳汁布氏瓊脂布魯氏菌菌落血平皿布氏菌菌落布氏菌革蘭染色3.1.6布氏菌鑒定程序分離培養(yǎng)純分離傳代玻片凝集初步鑒定，陽(yáng)性血清、因子血清凝集H2S產(chǎn)生試驗(yàn)，CO2培養(yǎng)依賴試驗(yàn)噬菌體裂解試驗(yàn)染料抑菌試驗(yàn)PCR檢測(cè)其他方法檢測(cè)生化測(cè)定脂肪酸分析PFGE等布氏菌噬菌體我國(guó)1981年起從國(guó)外引進(jìn)布氏菌分型噬菌體，對(duì)鑒定布氏菌有良好使用價(jià)值，可以將布氏菌鑒定到種目前使用的噬菌體有TbFiBK2WbRR/OR/C噬菌體對(duì)布氏菌的裂解羊種布氏菌噬菌體裂解分離培養(yǎng)基商用培養(yǎng)基布氏瓊脂布氏肉湯制備培養(yǎng)基肝浸液瓊脂血瓊脂培養(yǎng)基胰蛋白眎瓊脂培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基添加劑（多種抗生素）商品添加劑多粘菌素B桿菌肽放線菌酮制霉菌素注意：PH7.2，瓊脂適量，適當(dāng)容器布氏菌培養(yǎng)鑒定新方法的應(yīng)用細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)PCR鑒定OMP31AMOS-PCR雙向血培養(yǎng)瓶血清學(xué)檢驗(yàn)3.23.2.1血清學(xué)診斷的意義3.2.2針對(duì)布病進(jìn)行的檢驗(yàn)3.2.3血清樣本的采集和保存

3.2.1血清學(xué)診斷的意義

人的布病診斷方法：綜合性診斷

（1）流行病學(xué)接觸史：密切接觸家畜、野生動(dòng)物（觀賞動(dòng)物）、畜產(chǎn)品、布氏菌培養(yǎng)物等或生活在疫區(qū)內(nèi)的居民（2）臨床癥狀和體征（3）實(shí)驗(yàn)室檢查：病原菌分離、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、抗人球蛋白試驗(yàn)具備（1）、（2）和（3）項(xiàng)中的任何一項(xiàng)檢查陽(yáng)性即可確定為布病病人

3.2.2針對(duì)布病進(jìn)行的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室檢查陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）病原菌分離：檢出布魯氏菌

（2）試管凝集試驗(yàn)：1：100（++）及以上

（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：1：10（++）及以上

（4）抗人球蛋白試驗(yàn)：1：400（++）及以上

（5）虎紅、平板凝集試驗(yàn)：出現(xiàn)可見(jiàn)凝集

（6）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)：皮試后24、48小時(shí)分別各觀察一次,皮膚紅腫范圍有一次在2.０×2.０厘米及以上（或４.０平方厘米及以上）虎紅、平板凝集試驗(yàn)和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)供初篩試驗(yàn)用對(duì)已確診的慢性病人和接種過(guò)菌苗的人，應(yīng)以臨床癥狀為主要依據(jù)，血清學(xué)試驗(yàn)效價(jià)高低，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)弱供參考

布氏菌的血清學(xué)診斷方法試管凝集試驗(yàn)(SAT)虎紅玻片凝集試驗(yàn)(RBPT)含巰基化物處理血清后的凝集試驗(yàn)（2ME試驗(yàn)）抗球蛋白試驗(yàn)(Coomb`s試驗(yàn))補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)乳環(huán)凝集試驗(yàn)(MRT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)金標(biāo)法熒光偏振方法（FPA）3.2.2.1、虎紅玻片凝集實(shí)驗(yàn)原理：利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性，主要檢查血清中的IgG類抗體。

評(píng)價(jià)：簡(jiǎn)便快速、容易操作，適用于基層大面積檢疫，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果僅供參考，不能作為確診依據(jù)。布病虎紅玻片凝集試劑試劑與器材虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片、微量移液器、槍頭。方法：在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，5min之內(nèi)觀察結(jié)果。結(jié)果判定：出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集反應(yīng)就判為陽(yáng)性；否則就為陰性。評(píng)價(jià)：簡(jiǎn)便快速、容易操作，漏檢率極低，適用于基層大面積檢疫；容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，臨床上需要借助SAT來(lái)確認(rèn)。注意事項(xiàng)血清靜止的溫度和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響，在一定的時(shí)間和溫度范圍內(nèi)，防治時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，假陽(yáng)性率越低；患者空腹血清出現(xiàn)假陽(yáng)性少；凡是試驗(yàn)中凝集顆粒不規(guī)則，大小不勻，片狀或絮狀，凝集不清澈者，一般為假陽(yáng)性，否則凝集顆粒規(guī)則，大小均勻，凝集清澈者，一般與SAT結(jié)果相符，為陽(yáng)性。原理：布氏菌侵入機(jī)體后，就會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，就會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，也就是用已知抗原查未知抗體。3.2.2.2、試管凝集試驗(yàn)3.2.2.2、試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)陰性布氏菌試管凝集陽(yáng)性布氏菌試管凝集抗原器材與試劑實(shí)驗(yàn)?zāi)乖⒈粰z血清、生理鹽水移液器、吸管、凝集管、試管架、稀釋抗原用的玻璃杯、37度溫箱。方法：每份血清取9支小試管，放于試管架上。血清稀釋稀釋抗原后；加入抗原溫育18-22小時(shí)室溫放置2小時(shí)后觀察結(jié)果比濁管配置

0.2ml血清2.3ml鹽水0.5ml抗原05ml棄去2.30.50.50.50.50.50.50.50.50.5ml鹽水1:1600比濁管的制備

—++++++++++生理鹽水（ml）0.000.250.500.751.00稀釋抗原（ml）1.000.750.500.250.001.000.750.500.250.250.500.751.001.001.001.001.00結(jié)果判定：根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應(yīng)程度（滴度），特別是50%清亮度（++）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對(duì)比判定。++++液體完全透明，菌體成傘狀沉淀或塊狀顆粒狀沉淀，呈100%凝集。+++液體近于完全透明，菌體成傘狀沉淀，呈75%凝集。++液體略微透明，菌體呈較薄傘狀沉淀，呈50%凝集。+液體不透明，管底有很不明顯的傘狀沉淀，呈25%凝集?！后w不透明，無(wú)傘狀沉淀。效價(jià)以產(chǎn)生50%凝集的血清最高稀釋倍數(shù)為受檢血清的效價(jià)。血清對(duì)照為清亮透明無(wú)沉淀，抗原對(duì)照為均勻渾濁，兩種對(duì)照管成立，才可判定試驗(yàn)管，否則重做。人的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1:100++為陽(yáng)性，1:50++為可疑。試管凝集實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)之一滴度1︰100及以上或病程一年以上者滴度為1︰50及以上為陽(yáng)性特異好，實(shí)用性、敏感性強(qiáng)主要檢查血清中的IgG和IgM，適合于急性期病人的診斷。缺點(diǎn)：有前帶現(xiàn)象，有時(shí)出現(xiàn)假陰性結(jié)果；長(zhǎng)生一定的交叉反應(yīng)；出結(jié)果慢，需要兩天注意事項(xiàng)受檢血清應(yīng)新鮮、無(wú)溶血、無(wú)污染，存放血清處溫度不能超過(guò)10℃，采血后應(yīng)于3-4日內(nèi)進(jìn)行檢查，因放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致血清效價(jià)降低。每份血清和抗原要有對(duì)照。個(gè)別血清會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，建議多做幾個(gè)管，多采用幾個(gè)稀釋度。3.2.2.3、抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（Coomb’s）原理：機(jī)體受布氏菌抗原刺激后可產(chǎn)生“完全抗體”和“不完全抗體”。不完全抗體可與相應(yīng)抗原結(jié)合，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。若將預(yù)測(cè)不完全抗體的人血清球蛋白作為抗原，注射于另一種動(dòng)物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗體，再將此球蛋白抗體加入到抗原與不完全抗體復(fù)合體中，即可出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。分為兩個(gè)階段:①不完全抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合為不可見(jiàn)階段②抗原抗體復(fù)合物有抗球蛋白抗體凝集而形成可見(jiàn)反應(yīng)評(píng)價(jià)：所查抗體主要是IgG、IgA；可以作為早期和追溯診斷；適用于亞急性和慢性病人；操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，一般不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。器材及試劑試劑：試管凝集抗原、被檢血清、抗被檢對(duì)象的血清球蛋白抗體、生理鹽水器材：普通離心機(jī)、溫箱、1ml及10ml吸管。方法：試管凝集試驗(yàn)階段抗球蛋白反應(yīng)階段吸取上項(xiàng)試驗(yàn)的可疑管和全部陰性管，4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，反復(fù)洗滌3次。向各管中加入生理鹽水0.5ml，混勻，再向各管中加0.5ml一定稀釋度的抗球蛋白血清，將反應(yīng)管置37℃溫箱中20-22小時(shí)，取出室溫放置2小時(shí)后判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)同試管凝集試驗(yàn)對(duì)照被檢血清對(duì)照（被檢血清+鹽水）試管凝集抗原對(duì)照（試管抗原+鹽水）抗球蛋白血清加生理鹽水對(duì)照抗球蛋白血清加試管凝集抗原對(duì)照抗球蛋白血清加被檢血清對(duì)照對(duì)照全部為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)才有意義我國(guó)試行的用于診斷人布病標(biāo)準(zhǔn)1:400及以上滴度。注意事項(xiàng)在進(jìn)行Coomb’s試驗(yàn)時(shí)，洗滌抗原很重要，如不認(rèn)真洗滌，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物質(zhì)，會(huì)干擾下一步加入抗球蛋白血清的反應(yīng)，掩蓋真正結(jié)果。一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之間的稀釋度。評(píng)價(jià)（1）布氏菌感染后，約在15天出現(xiàn)不完全抗體，3個(gè)月左右達(dá)到高峰?？沙掷m(xù)一年左右。該實(shí)驗(yàn)可作為早期和追溯診斷。（2）該試驗(yàn)特異性較強(qiáng)，尤其適用于診斷亞急性和慢性病人，所查抗體主要為IgG、IgA類。（3）一般不作為常規(guī)項(xiàng)目，在試管凝集試驗(yàn)為可疑，患者又處于慢性期時(shí)，可考慮抗球蛋白試驗(yàn)予以診斷。3.2.2.4、布氏菌補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理：綿羊紅細(xì)胞和溶血素可以形成結(jié)合物，在補(bǔ)體的作用下，發(fā)生溶血。在反應(yīng)體系中，他們作為指示系統(tǒng)，與布氏菌的特異性抗原、抗體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合補(bǔ)體。如果發(fā)生溶血，說(shuō)明血清中沒(méi)有特異性抗體，判為陰性，即不是布病患者。評(píng)價(jià)：主要檢