核醫(yī)學第8章受體的放射性配基結(jié)合分析

受體:細胞表面或亞細胞組分中的一種分子，可以識別并特異地與有生物活性的化學信號物質(zhì)(配體)結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應，最后導致該信號物質(zhì)特定的生物效應。迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體都是具有特定氨基酸序列和特定構(gòu)型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細胞上都有特定的宏觀分布和微觀分布。

§1.概論當前1頁，總共63頁。一、受體功能識別特異的信號物質(zhì)--配基，識別的表現(xiàn)在于兩者的特異結(jié)合。把識別和接受的信號準確無誤的放大并傳遞到細胞內(nèi)部，同時啟動一系列胞內(nèi)生化反應，最后導致特定的細胞反應，使得胞外信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號。當前2頁，總共63頁。受體接受細胞外的特定信號(神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物和毒物等，稱為配基，ligand)，通過受體后特定的信號傳遞系統(tǒng)，引起細胞特定的生物效應，因此是高等動物適應環(huán)境、協(xié)調(diào)整體各種細胞功能的關鍵性分子。受體及其信號傳遞系統(tǒng)參與了體內(nèi)多種生理、病理過程，例如腫瘤的生成、免疫應答、補體激活等。當前3頁，總共63頁。根據(jù)在細胞中的定位，把所有的受體分為:膜受體核受體

二、受體的分類:當前4頁，總共63頁。1、膜受體：膜受體的分子一般由幾條到幾十條氨基酸鏈組成胞膜外、胞膜內(nèi)及跨膜區(qū)三部分。配基從細胞的外側(cè)與受體的胞外部分或跨膜部分上特定的結(jié)合位點結(jié)合，使受體分子發(fā)生構(gòu)型變化，通過膜內(nèi)部分將信息傳給相應的信息傳遞機制，引起細胞功能變化。

當前5頁，總共63頁。根據(jù)膜受體的跨膜結(jié)構(gòu)又可以分為：單鏈跨膜受體：包括酪氨酸激酶型受體，如各種生長因子受體；非激酶型受體，如細胞因子受體。G蛋白偶聯(lián)受體：受體的氨基酸鏈7次跨越細胞膜，在人體內(nèi)分布很廣泛。離子通道型受體：受體的幾個組成亞單位豎插入膜，中央形成空隙即為離子通道，如N-膽堿能受體、甘氨酸受體等。當前6頁，總共63頁。當前7頁，總共63頁。當前8頁，總共63頁。2、核受體：為一條氨基酸鏈，可分為四個功能區(qū)：A/B區(qū):在不同受體中差異最大，主要功能是選擇和激活基因轉(zhuǎn)錄。C區(qū):與染色體DNA結(jié)合的區(qū)域，上面有一定的氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序列(稱作反應原件,responseelement)相結(jié)合。D區(qū):主要作用是受體在核內(nèi)的定位。E區(qū):與配基結(jié)合的區(qū)，并有轉(zhuǎn)錄激活作用。

當前9頁，總共63頁。受體的亞型受體亞型：在分子結(jié)構(gòu)上既有相似之處，又存在一定的差別，對一定的配基具有不同的親和力，在生物學上具有不同的效應。在藥理實驗等研究中發(fā)現(xiàn)，許多受體存在著兩種或兩種以上的亞型。只有內(nèi)源性配基相同而氨基酸序列同源性很高的受體才可列為同一型的不同亞型。例如表皮生長因子受體家族就包括表皮生長因子、HER2、HER3、HER4等四個成員。當前10頁，總共63頁。受體數(shù)量：占細胞蛋白總量十萬之一到百萬分之一（一個細胞上僅有數(shù)千個受體分子），一般方法難以分離和測定受體分子。

當前11頁，總共63頁。配體：是指能和受體結(jié)合并引起相關效應的化合物。除了與受體結(jié)合外本身并無其他功能，它不能參加代謝產(chǎn)生有用產(chǎn)物，也不直接誘導任何細胞活性，更無酶的特點，它唯一的功能就是通知細胞在環(huán)境中存在一種特殊信號或刺激因素。當前12頁，總共63頁。

三、受體與配體的結(jié)合

配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠氫鍵、離子鍵與范德華力的作用，隨著兩種分子空間結(jié)構(gòu)互補程度增加，相互作用基團之間距離就會縮短，作用力就會大大增加，因此分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特異結(jié)合的主要因素。

同一配體可能有兩種或兩種以上的不同受體，例如乙酰膽堿有煙堿型和毒蕈型兩種受體。同一配體與不同類型受體結(jié)合會產(chǎn)生不同的細胞反應，如Ach可以使骨骼肌興奮，但對心肌則是抑制的。

配體可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物等。當前13頁，總共63頁。四、受體與配基結(jié)合的特性

1、可飽和性(saturability)：每種受體在一個細胞上的量有一定限度，所以如果不斷增加細胞周圍配基的濃度，結(jié)合到細胞上的配基將漸趨飽和。當前14頁，總共63頁。2、可逆性：如果在放射配基與受體結(jié)合后將受體周圍多余的放射配基移去(例如淋洗或透析)，則放射配基與受體的復合物會逐步解離，亦即這種結(jié)合是可逆反應。如果向反應系統(tǒng)中加入大量非標記配基，使其濃度遠高于放射配基，則將取代大部分原已結(jié)合的放射配基，使放射性復合物減少,也說明配基與受體的結(jié)合是可逆的。

解離后的配基是原形，不起代謝變化。

當前15頁，總共63頁。3、特異性和親和性：受體的特異性：受體具有特異識別配基的性能，因此只有嚴格構(gòu)型和構(gòu)象的配基分子才能選擇性地與受體結(jié)合。受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織（靶器官）的專一性上，如雌激素對子宮等器官有興奮作用，這是因為這些器官上雌激素受體的數(shù)量明顯高于其它器官。受體的親和性是指受體和配基的結(jié)合能力，受體親和性高就說明受體和配基結(jié)合牢固，不容易解離。當前16頁，總共63頁。4、與效應的一致性：受體的主要功能是介導配體的生物效應，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導特定的生物效應，那么這種蛋白不能稱之為受體。配體與受體結(jié)合后，引起陽性生理效應，稱為激動劑。配體與受體結(jié)合后，阻斷內(nèi)源性配基的陽性生理作用，稱為拮抗劑或阻斷劑。

當前17頁，總共63頁。五、受體的生理調(diào)節(jié)正常生理狀態(tài)下的受體處在一個不斷合成與降解的動態(tài)平衡中，但其數(shù)量和親和性也會因疾病、藥物作用而發(fā)生變化。1、向下調(diào)節(jié)(down-regulation)

細胞所處環(huán)境中某種激動劑濃度增高或長期作用，結(jié)果使其相應受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體對此物質(zhì)的敏感性下降或耐受性增高等現(xiàn)象。如哮喘病人長期服用β-激動劑產(chǎn)生耐受性增高，即藥效減弱。當前18頁，總共63頁。2、向上調(diào)節(jié)(up-regulation)細胞所處環(huán)境中某種拮抗劑的濃度過高或長期作用，結(jié)果會使受體數(shù)量增高，出現(xiàn)受體敏感性增高，表現(xiàn)為增敏或撤藥后反跳現(xiàn)象。如高血壓病人長期服用心得安，若突然停藥，可出現(xiàn)血壓升高的反跳現(xiàn)象。由于受體在整體條件下，隨機體狀態(tài)變化，會出現(xiàn)生理調(diào)節(jié)，因此對受體數(shù)量和親和性測定就成為研究病理變化和評價藥效的重要內(nèi)容。

當前19頁，總共63頁。六、受體與疾病遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病的常見原因1、基因突變致使受體異常，引發(fā)功能障礙，絕大多數(shù)是功能降低或完全喪失，有家族史，病情嚴重。如睪酮受體基因突變致該受體缺陷引起睪丸完全雌性化病。2、機體對受體產(chǎn)生自身抗體，激動（如Graves綜合癥患者產(chǎn)生TSH受體抗體，直接持續(xù)激動甲狀腺TSH受體）或阻斷（如重癥肌無力患者產(chǎn)生N-Ach受體抗體，占領但不激動受體）受體。3、某些病有受體異常，非原始發(fā)病環(huán)節(jié)，為發(fā)病重要環(huán)節(jié)，采取針對措施可控制病情。甲亢用β腎上腺素阻斷劑，哮喘用β腎上腺素激動劑。4、受體與腫瘤：某些受體基因可突變成為癌基因，引發(fā)腫瘤；激素受體在腫瘤中存在與否決定治療方案（乳腺癌，白血?。?。當前20頁，總共63頁。§2.受體-配基結(jié)合反應的基本原理

RBA(radioligandbindingassay)的基本原理與IRMA基本相同，應用放射性標記配體，在一定條件下與受體（R）結(jié)合成配體與受體復合物（R－*L），分離并測定R－*L的放射性，然后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，對受體的性質(zhì)進行定性和定量的分析。當前21頁，總共63頁。定性RBA：是通過反應的量效關系的變化來判斷受體的類型，單位點或多位點結(jié)合式，及受體與配體結(jié)合的特點，反應的可逆性、協(xié)作性等。定量RBA：是在已知配體與受體反應性質(zhì)的基礎上，通過結(jié)合反應，給出一定量的組織或細胞中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)及結(jié)合的平衡解離常數(shù)或結(jié)合位點數(shù)（最大結(jié)合容量）。

當前22頁，總共63頁。RBA的優(yōu)點：高靈敏度：高比活度的配基和高親和力的受體反應必然會產(chǎn)生高靈敏度的分析技術。RBA的靈敏度可以達到10-15mol/l；特異性強：受體和配基的結(jié)合特異性和專一性保證了方法的特異性;受體制劑的多樣性：同一組織或細胞上有多種受體，因此某種組織或細胞制劑可以用多種配基做受體分析；動物受體和人的受體存在相容性，在動物上獲得的知識，多數(shù)可以用于人類。當前23頁，總共63頁。(一)簡單單點系統(tǒng)受體與配基相互結(jié)合的基本規(guī)律簡單單位點系統(tǒng)：對某種受體而言，其所有的受體具有完全相同的結(jié)合特異性和生理效應，且所有受體都只有一個結(jié)合位點，以1：1的關系與配基結(jié)合，不表現(xiàn)明顯的正負協(xié)同效應。有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩(多)種亞型，但結(jié)合的配基無選擇性，盡管亞型的生物效應可能不全相同，結(jié)合反應卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時，也可作為單位點系統(tǒng)來看待。當前24頁，總共63頁。將上式展開重排，得到當前25頁，總共63頁。可以看出，[RL](復合物濃度)和[LT](配基總濃度)并非線性關系，而是曲線關系。對一定數(shù)量([RT](受體總濃度)固定)和一定親和力(KD固定)的受體來說，配基濃度從零開始上升時，復合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大多數(shù)受體都變?yōu)閺秃衔?，也就是受體被飽和了。這就是飽和曲線。

當前26頁，總共63頁。曲線的高度主要反映受體的數(shù)量多少，受體越多，曲線高度越高；曲線上升的快慢取決于配基與受體的親和力，所以，KD越小(親和力越大)，飽和曲線上升越快，KD越大(親和力越小)，飽和曲線上升越慢。當前27頁，總共63頁。(二)Scatchard作圖：將改寫成在繪制飽和曲線時，以復合物濃度[RL]為橫坐標，以復合物和游離配基的濃度比值[RL]/[L]為縱坐標，則對簡單單位點系統(tǒng)來說，將得到一條逐漸下降的直線。當前28頁，總共63頁。Scatchard作圖目前，Scatchard作圖主要用于定性，即判斷是否簡單單位點，還是有其它復雜情況。例如同一系統(tǒng)中同一種受體有兩種以上親和力的亞型，或者受體有正協(xié)同或負協(xié)同作用(Scatchard作圖呈曲線)當前29頁，總共63頁。（三）正負協(xié)同作用

當一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變，倘若親和力逐步下降，稱之為負協(xié)同作用如曲線(2)，親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用如曲線(3)。

負協(xié)同正協(xié)同當前30頁，總共63頁。（四）非特異結(jié)合（non-specificbinding，NSB）

上述飽和曲線是受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種結(jié)合的特點是低容量和高親和力，所以容易飽和。但是，任何受體標本除特異結(jié)合外，還會有一部分非特異結(jié)合，當分離特異結(jié)合的復合物測量放射性時，這部分非特異結(jié)合的放射性混在一起，測到的是總放射性(totalbinding,TB)，必需先減去非特異結(jié)合(NSB)，才能得到特異結(jié)合(specificbinding,SB)的放射性。

當前31頁，總共63頁。NSB主要來自雜蛋白，反應器壁，分離材料的吸附，它的特點是，容量很大，而親和力低，因此在一般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它不呈飽和曲線，而是一條上升的直線。當前32頁，總共63頁。（五）受體與配基反應的動力學（kinetics）

受體與配基的結(jié)合反應一般都較快（多數(shù)在數(shù)十秒至數(shù)十分鐘）達到平衡。當周圍的游離配基急劇下降，或非標記配基濃度急劇升高時，放射性復合物的解離也很快，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的迅速反應有很重要的意義。大量非標記配基當前33頁，總共63頁。（六）競爭性取代反應

在一個受體和放射配基的反應系統(tǒng)中加入另一個化合物，它若能和受體的結(jié)合位點結(jié)合，則會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放射配基與受體形成復合物的能力降低，但受體數(shù)量不變,所以叫競爭性取代反應。此時，非標記的起競爭作用的配基稱為競爭劑,它們和受體結(jié)合后不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。當前34頁，總共63頁。表示競爭劑抑制作用強弱的指標：IC50值和KI。IC50值：指抑制50％受體與放射配基結(jié)合所需競爭劑的濃度，IC50值大，表明競爭劑抑制作用小。KI：競爭劑的平衡解離常數(shù)，KI越小，表明競爭劑抑制作用越大。

當前35頁，總共63頁。二、雙（多）位點系統(tǒng)一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每種亞型都有相應的KD值（自學）。當前36頁，總共63頁?！?.受體放射分析的基本方法

RBA的方法學：一般RBA分析都是以求得樣品中的受體數(shù)量[RT]為目的。用定量的受體制劑與大量的標記配基反應，使受體得以飽和。分離受體-標記配基復合物，測量其放射性。根據(jù)復合物的放射性計算受體的結(jié)合容量或結(jié)合位點數(shù)。當前37頁，總共63頁。

離體RBA基本方法的流程為：

當前38頁，總共63頁。一、受體標本的制備

在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細胞或游離活細胞，粗制的或純化的細胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。

（一）組織切片冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標記配基進行反應。反應后用緩沖液洗幾次即可，切片厚度一般為5-50μm。用組織切片的目的更多是研究受體的分布（用放射自顯影法或免疫組化）。

當前39頁，總共63頁。（二）游離的完整細胞懸液完整的活細胞可以是血細胞，培養(yǎng)的單層細胞，腫瘤的腹水型細胞以及經(jīng)處理的原代細胞等。使用完整細胞的優(yōu)點：1、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)pH、離子梯度也保存著。受體與其相連的效應系統(tǒng)（如G蛋白）也保存完好。2、在受體功能反應完全的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體結(jié)合的情況和細胞的生物效應。所得的結(jié)果更能反映受體的生理特點。3、能直接給出平均每一個細胞的受體數(shù)。當前40頁，總共63頁。注意點：完整細胞的受體分析必須盡可能選用不易穿透細胞膜雙層磷脂的標記物，否則由于游離配基進入細胞內(nèi)可引起較大誤差。此外，還必須注意防止操作過程中可能導致細胞表面生理活性的改變。如，完整細胞的膜受體在37℃時會發(fā)生受體入內(nèi)化現(xiàn)象，這會破壞結(jié)合反應的平衡狀態(tài)，導致測定的KD值不正確，如80%EGF受體入內(nèi)化，而在4℃則可阻止入內(nèi)化。當前41頁，總共63頁。（三）亞細胞組分

大多數(shù)受體的RBA需經(jīng)差速離心法分成胞膜、胞漿、胞核，取所需組分進行分析。其優(yōu)點是：除去大部分雜蛋白和內(nèi)源性配基，減少NSB或其它干擾因素；受體蛋白得到初步濃縮，使富集的受體制劑獲得可靠的分析結(jié)果。當前42頁，總共63頁。亞細胞組分的分離一般都采用差速離心法。一般先制成勻漿，再在含0.25～0.3mol/L蔗糖緩沖液中先后以不同離心力進行離心，分離不同的亞細胞組分。當前43頁，總共63頁。實驗過程應注意：全部過程在4℃下進行操作，以保證受體標本的結(jié)合活性；制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，pH值及其它物質(zhì)（如EDTA，Mg2＋）應嚴格控制。為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑。

當前44頁，總共63頁。二、放射性配基的選擇

制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有好幾種標記配基可供選擇。選擇應從兩方面考慮：①配基的特性；②實驗目的。

當前45頁，總共63頁。（一）對放射性配基的基本要求1、高比活度：組織細胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約104-105個/細胞，或0.01-1.0pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基難于達到分析靈敏度的要求。一般要求比活度在3.7×1011Bq/mmol以上。2、高親和力:可以減少標記配基用量放射性配基與受體的結(jié)合物解離較慢，有利于結(jié)合和游離配基的分離。當前46頁，總共63頁。3、高特異性:即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，選擇對某一受體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。4、高的穩(wěn)定性及放化純度:包括標記的穩(wěn)定性、貯藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性。具有95%以上的放化純度。

總的來說,配基的選擇要根據(jù)實驗目來定。當前47頁，總共63頁。目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3H、125I標記。3H標記配基與原型配基為同型式，生物學活性好，多數(shù)情況下比活度也能達到要求，且半衰期長，使用方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般實驗室不能進行標記。多肽及蛋白質(zhì)配基多用125I標記，其優(yōu)點是可以達到較高的比活度。只要很好掌握標記條件，仍能保持較好的生物活性。另外，碘標記法快速、方便、經(jīng)濟，一般實驗室可進行。當前48頁，總共63頁。（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定1、放射化學純度:

除新鮮產(chǎn)品外,存放一定時間后的標記配基均應重測其放化純度，以保證分析的準確性。一般要求放化純度應在95％以上。2、結(jié)合活性鑒定

3、比活度：受體結(jié)合分析的結(jié)果計算離不開準確的比活度數(shù)據(jù)。當前49頁，總共63頁。三、受體放射分析的類型

（一）標記配基飽和法1、單點飽和法：定量受體制劑加大量的標記配基使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體-配基復合物的放射性計算受體結(jié)合容量（或結(jié)合位點數(shù)）。這種方法操作簡便、標本用量少。但只憑單點實驗數(shù)據(jù)計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不能給出KD，誤差也相對大些。

當前50頁，總共63頁。2、多點飽和法：一定量的受體制劑，逐步增加標記配基的量（一般7-8個實驗點），使受體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力（RT、KD），結(jié)果可靠性高。但受體標本、標記配基用量大，工作量大。

當前51頁，總共63頁。（二）非標記配基飽和法

一定量的受體和標記配基，逐漸增加非標記配基（一般7－8個實驗點），使受體飽和結(jié)合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力。

這種方法克服了多點飽和法標記配基用量大的缺點，但由于非標記配基的用量逐漸加大，放射性逐步減少，必需標記配基比活度較高才能得到滿意結(jié)果。

當前52頁，總共63頁。四、分析條件的選擇（一）標記配基濃度

試驗類型不同，選用的標記配基濃度也有不同。單點飽和試驗要求飽和量的標記配基。對于多點飽和試驗，應盡可能覆蓋飽和區(qū)及非飽和區(qū)，還應考慮最低一點有足夠的放射性滿足放射性測量統(tǒng)計上的要求，最高一點的濃度則往往要考慮配基的來源及價格。

（二）受體濃度一般說在一定范圍內(nèi)受體結(jié)合位點隨組織量的增加而增加，特異性結(jié)合量與組織濃度成線性關系。在線性范圍內(nèi)，較高受體濃度，有時可增加特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比值，有人提出，受體濃度應選為約相當于KD值。在實踐中，往往需要通過實驗來確定受體濃度。

當前53頁，總共63頁。（三）溫育溫度與時間溫度是影響反應速率的重要因素。溫度高，結(jié)合快，達到反應平衡時間短，溫度低，反應終止時容易降溫，減少分離過程中復合物的解離。另外，溫度低對配基及受體的穩(wěn)定性有利。不同受體結(jié)合系統(tǒng)的最佳溫度和時間要經(jīng)過試驗選定。對于飽和或競爭取代試驗，應要求反應達到平衡，故溫育時間應足夠長以達到平衡狀態(tài)。溫育溫度與平衡時間是緊密相關的，不同的受體結(jié)合系統(tǒng)的反應平衡時間因親和力、溫育溫度、配基及受體濃度的不同而不同。一般室溫（22℃）操作比較方便。0℃溫育平衡時間雖然長一些，但其結(jié)果之重復性更好。

當前54頁，總共63頁。（四）緩沖液結(jié)合分析使用過多種緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，Tris-HCI緩沖液等，所選緩沖液應不干擾結(jié)合，并在較大范圍內(nèi)可穩(wěn)定pH。一般說，結(jié)合分析的pH應處于生理范圍，即pH=7-8。

鈉、鎂等離子在不同的受體系統(tǒng)中會有不同的影響。因此要根據(jù)具體目的決定選用與否。如果加入的受體蛋白量較少時，宜在緩沖液加入適量蛋白，使反應液內(nèi)蛋白濃度為0.1mg-1mg/ml為好。為了阻止肽類的降解，常在分析時加入各種肽酶抑制劑。但要視具體是哪種肽而定，以確保實際有效。因為有些蛋白酶抑制劑有抑制特異性結(jié)合的作用。當前55頁，總共63頁。五、結(jié)合體與游離配基的分離

受體-配基結(jié)合分析主要是測定反應平衡時結(jié)合配基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反應一般在達到平衡后先經(jīng)分離，再測結(jié)合部分的放射性。

理論上，一經(jīng)分離，反應的平衡就會被破壞，所以選擇適當?shù)姆蛛x方法和環(huán)境，使受體-配基復合物在分離過程中的解離減少到最低限度。低溫是降低解離的最有效手段，分離快慢也是重要因素。常用的分離方法有離心法、濾膜法、吸附法、透析法、電泳法等。若復合物解離快，則只能選擇快速的分離方法。同時一定要在分離時間，分離溫度等方面保持各樣品管之間的一致性，以減少誤差。當前56頁，總共63頁。

（一）抽濾法（濾膜法）

1、選用的濾膜材料：既能阻擋復合物又不要過多產(chǎn)生對游離標記配基的非特異性吸附。常用的濾膜是玻璃纖維濾膜。

2、影響因素（1）復合物的解離：一般說，低溫時解離較慢，故濾膜及緩沖液應保存于低溫。用冰冷緩沖液抽洗為好。（2）負壓：若為多頭抽濾器，應注意各孔壓力的均一性（3）標記配基對濾膜的吸附：標記配基吸附于濾膜是抽濾法非特異性結(jié)合的主要來源之一。也是抽濾法的主要缺點，減少標記配基吸附于濾膜的方法有：①濾膜預先用非標記配基浸泡；②如果是多肽或蛋白標記配基，用

1％白蛋白浸泡；③用一定量的淋洗液或保證一定淋洗次數(shù)，充分淋洗。當前57頁，總共63頁。（二）離心法

這也是常用方法之一，很多受體分析建立之初都用此法，離心法可以在復合物很少解離的狀態(tài)下達到較好的分離效果，但非特異性較高。（三）吸附法

上述分離方法均系分離后測定復合物的放射性。但當研究可溶性受體時，如類固醇激素受體，上述方法就不適合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑石粉、葡聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。目前，已廣泛應用葡聚糖衣活性炭。它是在固相炭素上包一層葡聚糖，形成分子篩的作用，吸附小分子的游離配基。這種炭液有一定的粘性，易于離心沉淀，分離效果好。