w03細胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細胞生物學(xué)研究方法一、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（一）光學(xué)顯微鏡：1、普通光鏡的性能指標(biāo)：放大率（放大倍數(shù)）分辨力、清晰度、焦點深度、鏡象亮度。分辨力（分辨率、分辨本領(lǐng)）：能分辨兩個物點之間最短距離的能力，通常是以分辨距離來表示的，即分辨距離越小則分辨力越高。

圖2-1尼康E-600顯微鏡人肉眼分辨力測試是規(guī)定在明視距離25cm所分辨的最短間距來表示，正常人肉眼分辨力的極限值是0.1mm(毫米)，顯微鏡的分辨力可按下列公式來計算R=0.61λ/N.A（R是分辨距離，0.61是常數(shù)，λ是照明光波波長，N·A是顯微鏡物鏡的鏡口率——光學(xué)性能指標(biāo)，每個物鏡上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。

∵顯微鏡的分辨力是有一定的極限，∴其放大率受分辨力制約而不可能無限提高，普通光鏡放大率的經(jīng)驗界值：有效放大倍數(shù)極限=物鏡鏡口率×1000。例普通顯微鏡的油鏡鏡口率為1.25,故此臺顯微鏡的最大有效放大倍數(shù)為1250倍。高級研究顯微鏡油鏡鏡口率為1.4，則此鏡的最大有效放大倍數(shù)為1400倍。

如果放大倍數(shù)超過限度，則視野中物象變模糊，細微結(jié)構(gòu)反倒分辨不清，成為了無效放大，由于物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質(zhì)折射率的限制，不可能更大提高，所以科學(xué)家們從兩個途徑來改進顯微鏡：ⅰ、換用短波長的照明光源提高分辨力，如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡；ⅱ應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)增強反差，提高分辨能力。圖2-1尼康E-600顯微鏡圖2-8相差顯微鏡照明原理當(dāng)光線穿過無色透明且非勻質(zhì)的被檢物體（例如活細胞）其波長和振幅都無明顯變化，僅光相位出現(xiàn)了一定程度變化，此時觀察感覺反差小，物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)難分辨，這就是普通光鏡不適宜用于觀察活細胞的原因，相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大，再經(jīng)過光波干涉作用，使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差，從而反差增強，使能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細微結(jié)構(gòu)，所以相差顯微鏡下的樣品不需染色，可清晰觀察活細胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。特點：相差顯微鏡有正反差和負反差兩種類型，正反差（暗反差）觀察效果是被檢物質(zhì)比周圍背景略暗，物體外圍顯現(xiàn)一圈亮的光暈，而負反差（明反差）的效果則是相反。圖2-9一種介殼蟲的染色體（PCM照片）圖2-2尼康E800熒光DIC顯微鏡圖2-3落射式照明原理圖2-4熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、

微絲紅色、核藍色）熒光顯微鏡目前在分子細胞生物學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，以熒光素標(biāo)記各種探針進行基因定位分析和對某些特異蛋白質(zhì)進行定性定位檢測分析，靈敏清晰，在熒光顯微鏡下對樣品可同時采用兩種以上（有的多達6~12種）熒光探針檢測，依據(jù)其不同顏色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因位點，因此這是非常實用的研究技術(shù)，此外，由于在熒光標(biāo)記檢測實驗中，易發(fā)生一些非檢測目標(biāo)出現(xiàn)假象的“背景噪音”問題，因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備上安裝一套“數(shù)字成像處理系統(tǒng)CCD”，即把圖像信息通過攝像機和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號反差可以放大增強，對假象削弱or削除從而明顯提高檢測的精確率和靈敏度。4.倒置顯微鏡：是將相差顯微鏡的構(gòu)件顛倒裝配，本末倒置而成的，并裝有恒溫設(shè)備，閉路電視和縮時攝像機，是完善的細胞培養(yǎng)和觀察監(jiān)視系統(tǒng)（光源在上，目鏡在下）、（培養(yǎng)皿，瓶中活細胞生長生活情況）。圖2-11萊卡倒置顯微鏡圖2-10DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）6.激光共焦點顯微鏡:激光共焦點顯微鏡的物鏡和聚光鏡是聚集同一焦點能排除平面以外熒光干擾，所以其分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.4~1.7倍，還可以“光學(xué)切片”方式觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2-5激光共聚焦掃描顯微鏡（二）電子顯微鏡1、透射電鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM）

透射電鏡的放大原理與光鏡基本類似，只不過是以電子槍所發(fā)射的高速電子流代替了照明光源，又以三組電磁線圈所構(gòu)成的磁透鏡代替了玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡。第一組磁透鏡能將電子流聚焦到樣品上（故稱為會聚鏡）；第二組磁透鏡能使穿透過樣品的電子射線折射形成初級放大像（稱為物鏡）；而第三組磁透鏡則是通過第一第二中間鏡和投影鏡進行連續(xù)三次的再放大，最終投射到熒光屏上，使電子圖象轉(zhuǎn)變成了可見的光學(xué)圖象。圖2-12JEM-1011透射電子顯微鏡特點：（1）照明光源不同；（2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同，是依靠改變磁透鏡的微磁電流強度來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的，也就是說，電流強度的變化引起了磁場強度的改變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化；（3）有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)，電子流的發(fā)射速度及波長皆取決于電壓的高低。通常透射電鏡的電壓達幾萬——十幾萬伏的高壓；（4）有高度真空的工作系統(tǒng)。因為高速運動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊，故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水（真空中水易蒸發(fā)or升華，電子流與水分子相碰，改變其方向，使成像模糊）因此說透鏡電鏡不能用來觀察活的樣品；（5）樣品厚度必須<900（即90nm,0.09um）這是因為電子穿透能力有限，樣品過厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會產(chǎn)生熱量，將原樣品燒出白斑，所以透鏡電鏡觀察的樣品須超薄切片（400~500）不能用普通電鏡下的組織切片（2~7um）；（6）標(biāo)本染色技術(shù)不同，電鏡標(biāo)本染色并不像光鏡標(biāo)本染色上各種顏色，而是使觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對比分明，反差強。所以電鏡標(biāo)本染色劑大多是重金屬鹽類。染色方法有正染、負染兩類，正染常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結(jié)構(gòu)較暗，背景較亮；負染則是使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結(jié)構(gòu)顯得明亮突出；（7）特殊的投影技術(shù)（真空噴鍍法）是對電鏡標(biāo)本的表面處理技術(shù)，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標(biāo)本，使其朝向發(fā)射原的表面沉積的金屬微粒多于背面，因而電鏡觀察時感覺反差極強，具立體感。（8）冰凍蝕刻（或冰凍斷裂）技術(shù)freezeetchingorfreeze-fracture是研究細胞各種膜相結(jié)構(gòu)的處理方法，先將樣品放入-190℃低溫下迅速冰凍，再在真空中用冷卻刀切割斷裂，隨后上升溫度，讓冰在真空中升華成水汽跑掉，斷裂面的細微結(jié)構(gòu)暴露出來，再用真空噴鍍儀在斷面上噴一層碳膜或鉑——碳膜（稱為“表面復(fù)型膜”）然后拿出真空之外，用有機溶劑將樣品溶解掉，置“表面復(fù)型膜”于銅網(wǎng)上，即可上電鏡觀察了，因此，電鏡下看到的實際上已不是樣品本身，而是樣品某一斷裂面的“人工復(fù)制品”，這是因為人為的這種表面變型膜能比生物樣品本身有更強的電子反差性能，能夠以富有立體感的浮雕形式精細地反映出某一斷裂的細微結(jié)構(gòu)。對于“冰凍蝕刻處理的生物膜各個面，國際上統(tǒng)一（規(guī)定命名稱為PS”代表面向細胞質(zhì)基質(zhì)的表面）。圖2-15肌動蛋白纖維的負染電鏡照片圖2-16冰凍蝕刻電鏡照片2、掃描電鏡（scanningelectronmicroscopeSEM）：

工作原則不同于透射電鏡，是以電子束在樣品表面掃描，用閃爍器收集樣品表面散射回來的二次電子信號，再經(jīng)放大，最后在熒光屏上顯示圖像。特點：不需要經(jīng)過復(fù)雜處理，即可觀察標(biāo)本的原始外表面。圖2-17JEOL掃描電子顯微鏡優(yōu)點：（1）可觀察較大，較厚的樣品（2）景深大（景深——聚焦后能清晰看到物象的前后距離范圍），所以圖像是十分逼真的三維立體形象（3）其放大倍數(shù)是從20~20萬倍的連續(xù)變倍，，不須重復(fù)多次對焦，故對觀察研究很方便（4）樣品可在樣品室內(nèi)做多方位的水平移動和轉(zhuǎn)動，便于從各個角度來觀察樣品的全貌。缺點：（1）分辨力不太高，僅3~10nm（2）不能觀察樣品內(nèi)部。圖2-18光學(xué)顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較圖2-19人類血細胞SEM照片（三）掃描隧道顯微鏡（scanningtunnellingmicroscopeSTM）

特殊顯微鏡，不是電鏡，是新型探測樣品外表的納米級微觀形貌的高級儀器，具有三維立體掃描物體表面的原子尺度高分辨能力，并能在常規(guī)大氣or液體條件下觀測樣品，無須強求真空環(huán)境，也不采用高能電子流攻擊樣品，故有利于觀察樣品的真實自然形態(tài)，這是目前開展納米結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的重要技術(shù)，已用于直接觀察DNA分子，蛋白質(zhì)分子及生物微精細結(jié)構(gòu)。掃描隧道顯微鏡原理二、細胞生化分析（一）組織化學(xué)和細胞化學(xué)染色法（histochemicalandcytochemicalstainingmethods）

利用某種顯色劑能與某種細胞成分特異性結(jié)合，顯示特定顏色的原理對組織和細胞內(nèi)某些成分進行定位和定性分析的研究方法，可對無機鹽蛋白質(zhì)，醛基、碳水化合物、脂類、核酸和酶類等多種成分檢測鑒定。例：孚爾根反應(yīng)（Feulgen）:

特定顯示DNA的細胞化學(xué)技術(shù)，其原理是經(jīng)稀鹽酸水解打開DNA上嘌呤堿與脫氧核糖之間的連接鏈，暴露出羥基，由于羥基還原作用與無色品紅（希夫試劑）結(jié)合形成紫紅色的化合物，據(jù)此可對細胞內(nèi)的DNA進行定性和定位檢測，此外，由于染色的深度與DNA濃度是成正比關(guān)系，所以當(dāng)孚爾根法染色后，再用顯微分光光度計測量，即可對細胞內(nèi)的DNA含量進行定量測定。再例：comori法顯示酸性磷（pi）酸酶（溶酶體標(biāo)志酶）（二）免疫細胞化學(xué):

（immunocytochemistry）依據(jù)抗體能與對應(yīng)的抗原自行相互識別結(jié)合的免疫學(xué)原理來檢測特定蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布狀況，首先將某種抗體聯(lián)結(jié)上標(biāo)記物（光鏡觀察用的標(biāo)記物是熒光素or酶，而電鏡觀察用的標(biāo)記物是膠體金），再與組織or細胞樣品混合反應(yīng)，隨后在光鏡or電鏡下檢查標(biāo)記物沉積的部位，即對抗原進行定位測定，如果標(biāo)記物是熒光素時，則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號部位，以顯示抗原存在位置。

抗體與抗原結(jié)合的方式分直接法和間接法兩種:(1)直接法是先將抗體與熒光素結(jié)合，然后將樣品用熒光素標(biāo)記的抗血清浸染，使熒光抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)后，再在熒光顯微鏡下鑒別抗原的存在部位。(2)而間接法的不同之處是在抗原——抗體初級的基礎(chǔ)上，再增加一種能同初級抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的次級抗體（即“抗抗體”），從而使初級反應(yīng)得到“放大”，以增強分析觀察的靈敏性和準(zhǔn)確性。如果與抗體聯(lián)結(jié)的標(biāo)記物是酶，則可采用與酶的底物反應(yīng)，產(chǎn)生呈某種顏色的沉積物，再依據(jù)這種特定顏色沉積物的出現(xiàn)位置，來對待測物質(zhì)的定性定位分析，這被稱為酶標(biāo)抗體法（酶聯(lián)反應(yīng)），例如辣根過氧化物酶是常被用作標(biāo)記物的酶，該酶可催化過氧化氫H2O2同二氨基聯(lián)苯胺發(fā)生氧化反應(yīng)，形成棕色的沉積物，從而可在光鏡或電鏡下進行觀察分析。當(dāng)不存在抗原時，但隨機出現(xiàn)了沉積（無論是否抗體與抗原結(jié)合，熒光素都會沉積，酶也與底物反應(yīng)）故采用洗脫來避免此現(xiàn)象。圖2-21人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片（三）顯微分光光度測定技術(shù)microspectrophotometry

細胞內(nèi)各種化學(xué)成分對光的吸收均有專一的波段，例如核酸是吸收紫外光260nm光波，氨基酸則吸收280nm光波，此外，有些細胞成分經(jīng)過細胞化學(xué)染色技術(shù)處理后，也可對可見光波有特定的吸收光譜，依據(jù)這種特性，運用顯微分光光度計可對某些細胞成分進行定位和定量分析。目前，最先進的顯微光譜分析儀器是流式細胞光度計。它是采用激光作為光譜測量光源，還采用了細胞流動系統(tǒng)和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所以一秒鐘可測定5000個細胞的多種參數(shù)，如DNA含量,蛋白質(zhì)含量，細胞體積和直徑等等。圖2-24用流式細胞計分選細胞（四）顯微放射自顯影microradiography

依據(jù)照相原理利用放射性同位素所發(fā)射出來的射線（主要是β粒子）使感光材料（照相乳膠）上產(chǎn)生潛影（此過程稱為“曝光，”即讓照相乳膠上的AgBr還原成Ag），再經(jīng)過顯影和定影，即可觀察到用同位素標(biāo)記的某種物質(zhì)在標(biāo)本中的位置和數(shù)量。常用的放射性同位素有3H、14C、32P和35S、等，用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-T），可測定DNA的合成代謝，用3H標(biāo)記的尿嘧啶核苷可研究RNA的合成代謝，用14-Cor35S標(biāo)記可研究蛋白質(zhì)的合成，由于此技術(shù)靈敏度很高，是對生物大分子進行精細定位的有效方法。其操作過程：（1）同位素標(biāo)記實驗樣品（2）樣品標(biāo)本制備（包括固定、包理、切片or超薄切片or滴片）（3）涂布乳膠（在暗室）（4）曝光（自顯影，在暗盒內(nèi)）（5）顯影、定影、清洗（6）染色（7）光鏡下或電鏡下觀察由于放射性同位素標(biāo)記有對人不安全，且操作步驟復(fù)雜，費時費工的缺點：因此目前在基因定性研究方面大多改用非放射性標(biāo)記方式——例如應(yīng)用生物素標(biāo)記或地高辛標(biāo)記來替代同位素，在生物素或地高辛上聯(lián)結(jié)熒光素或酶，再以熒光顯微鏡或酶聯(lián)反應(yīng)來檢測，效果亦很好。（放射性同位素對操作者不安全，廢渣、廢水處理對環(huán)境污染，只有在對實驗要求靈敏度很高的實驗中使用）。（五）超速離心技術(shù)ultracentrifugation

是細胞生化分析研究的基礎(chǔ)實驗方法，是分離純化細胞亞微結(jié)構(gòu)和生物大分子的重要技術(shù)手段，超離心可達幾萬——幾十萬轉(zhuǎn)/分（g）的高轉(zhuǎn)速，各種細胞亞微顆粒在離心場中的沉降速率不一樣，衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強度離心場中沉降速率的量度，稱為沉降系數(shù)。沉降系數(shù)的單位叫斯維伯格單位Svedbergunit簡稱“S”，各種細胞亞微結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)顆粒都具有各自固定的S值。1、差速離心differentialcentrifugation是利用不同離心速度所產(chǎn)生的離心力差別，可將大小不同的亞微結(jié)構(gòu)顆粒分離開，此法適用于分離沉降速率差別較大的亞微結(jié)構(gòu)顆粒，而對于差別較小的則應(yīng)采用密度梯度離心法。2、密度梯度離心densitygradientcentrifugation首先將離心溶液制備成連續(xù)or不連續(xù)增高的密度梯度，其密度變化的范圍與待分離顆粒的密度大致相當(dāng)，然后通過一段時間離心操作后，不同密度的顆粒就會分別集中在相應(yīng)的密度梯度區(qū)帶之中，得以分離。圖2-22差速離心

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體

與過氧化物酶體常用的密度梯度離心方法有兩種：（1）蔗糖密度梯度離心，即事先配制一系列不同濃度的蔗糖濃度，分先后順序緩緩注入，離心管制成自下而上速減的濃度梯度（5~20%或10~60%）再將待分離的顆?；旌蠎乙杭釉谧钌厦?，然后在離心過程中，這些顆粒在蔗糖濃度梯度中沉降，當(dāng)沉降達到平衡狀態(tài)時，不同類型的顆粒便會分別集中在不同濃度區(qū)帶，最后掌握在顆粒區(qū)帶到達管底前停止離心按區(qū)帶分別收集樣品（在管底開口）（2）氯化銫密度梯度離心，氯化銫的密度梯度不需事先制備，而是在離心場中自行形成穩(wěn)定的連續(xù)梯度，在離心前，將待分離的生物大分子懸液加入氯化銫溶液中，離心時氯化銫形成穩(wěn)定梯度后各種生物大分子便會向梯度中相當(dāng)?shù)母×γ芏鹊奈恢靡苿?，最終每種類型的大分子在等密點形成一條狹窄的帶，因此這種方法又被稱為等密度梯度離心。圖2-23.密度梯度離心

A.等速度沉降(分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器)，

B.等密度沉降(分離密度不等的顆粒)

三、細胞生理測試（一）細胞膜電位測定:細胞膜內(nèi)外兩側(cè)的陽離子濃度不同，通常是外高內(nèi)低（外正內(nèi)負），造成細胞膜內(nèi)外具有一定的電位差，被稱為膜電位，例如一般動物細胞的膜電位是60~90mv，膜電位的變化能反映細胞生理變化，譬如當(dāng)神經(jīng)興奮信號傳導(dǎo)時，或肌肉收縮運動時，膜電位都發(fā)生顯著變化。測量膜電位采用微電極，微電極是由毛細玻璃管構(gòu)成，管內(nèi)注滿KCL溶液，插入一根銀絲，Ag絲用導(dǎo)線與電位計or示波器連接。測量時使用一對微電極，一個插入細胞內(nèi)，一個插在細胞外的介質(zhì)中即可以電位計or示波器來顯示和記錄細胞內(nèi)外的電位變化。（二）細胞電泳cellelectropboresis

細胞表面的分子具有電荷基團，因此在外加電場作用下，懸液中的細胞都會朝正極泳動這稱為細胞電泳，不同類型的細胞or處于不同生理狀態(tài)下的同種細胞，由于其細胞表面的電荷是有所不同，所以在同電場中的電泳對研究細胞癌變有重要作用，此外，細胞電泳裝置還能用來分離不同種類的活細胞。流式細胞術(shù)是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%（圖2-24）。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞儀（flowcytometer）。圖2-24用流式細胞計分選細胞四、其它實驗技術(shù)（一）細胞培養(yǎng)cellculture

胚胎培養(yǎng)——離體組織culture——細胞culture.細胞culture是細胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究技術(shù)，同時在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用價值。原理：將生物體的某一類群細胞，甚至單個細胞分離出來，放入具有適合細胞生活條件的培養(yǎng)器皿中，維持并促進其正常生長和繁殖。技術(shù)環(huán)節(jié)：

細胞分離，culture條件和培養(yǎng)基，細胞分離方式——機械分解，酶解處理，動物組織細胞通常以胰蛋白酶消化細胞內(nèi)的聯(lián)結(jié)，植物組織細胞則多以纖維素酶和果膠酶消化細胞壁等聯(lián)結(jié)物質(zhì)，細胞培養(yǎng)條件要盡可能與生物體內(nèi)生理狀況一致。主要是培養(yǎng)溫度，PH值和滲透壓等，此外，細胞culture還必須保持嚴格無菌，因為離體細胞已脫離了生物體免疫系統(tǒng)保護，是極易受bacteria.真菌等微生物的污染侵害，培養(yǎng)基的選擇是決定culture成敗的技術(shù)關(guān)鍵，培養(yǎng)基主要成分包括：各種氨基酸，維生素，碳水化合物，無機鹽以及能促進細胞生長，分裂的生長素，細胞激動素等，動物細胞culture基中還需要增添胎牛血清。細胞培養(yǎng)方式：液體懸浮培養(yǎng)，平板培養(yǎng)，回轉(zhuǎn)玻璃管培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)的名詞概念：（1）傳代：當(dāng)培養(yǎng)細胞長滿一層后，分瓶接種再培養(yǎng)，每傳一次稱為一代（同時分裂生長接觸一致）（2）原代細胞：指從組織中分離出來，連續(xù)培養(yǎng)五代之內(nèi)的細胞（3）傳代細胞：連續(xù)培養(yǎng)五代以后的細胞（4）細胞株(cellstrain):從原代培養(yǎng)物中接種出來的一群不均一的細胞群（染色體數(shù)目不變，不能無限長期傳代、繁衍）。

（5）細胞系：cellline是具有固定特性和標(biāo)志的一個類型培養(yǎng)細胞。

細胞系一般都是轉(zhuǎn)化細胞，可以無限傳代長期繁衍下去，每種細胞系都具有特殊的遺傳標(biāo)志特征，例如具有某種生化藥劑的抗性突變基因，而且這些遺傳標(biāo)志在繼續(xù)培養(yǎng)中可保持穩(wěn)定不變這樣才能被學(xué)術(shù)界公認為是一個新的細胞系，（接觸不一致，染色數(shù)目突變）。

細胞系是供細胞遺傳學(xué)，細胞生理學(xué)、免疫病理學(xué)研究工作用的好試驗材料，

例如：Hela細胞系是1953年取自一位美國黑人婦女子宮頸癌上皮細胞，現(xiàn)在全世界都采用該細胞系做人類細胞生化等研究研究的典型材料；再如世界著名的動物的細胞試驗材料之一：CHO細胞line(Chinesehamsterootheea)取自中國倉鼠卵巢組織的細胞系。（6）克隆clone：

即無性繁殖系。目前有植物clone,動物clone,微生物clone,胚胎clone,細胞clone和分子clone之分，細胞clone即指由單個細胞培養(yǎng)繁殖而成的一群遺傳性狀完全相同的細胞群體，如果一個細胞系是通過clone形成法產(chǎn)生的，那么這個細胞系就可稱為一個clone。圖2-25群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）圖2-26植物細胞培養(yǎng)單克隆抗體技術(shù)是細胞雜交技術(shù)的成功應(yīng)用，正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein1975將兩種細胞雜交，產(chǎn)生了能無限繁殖并能分泌抗體的雜交細胞而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。圖2-27單克隆抗體技術(shù)（二）細胞顯微操作技術(shù)micromanipulation

運用結(jié)合操作可對細胞進行微量注射，細胞核移植、膜電位測定、胚胎切割和gene轉(zhuǎn)移等多種細胞生物學(xué)研究工作。顯微操作技術(shù)器的主體部分是光學(xué)顯微鏡加上顯微操縱儀組成，顯微操縱儀是能精密