分子發(fā)光分析

分子發(fā)光分析第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)過程中，以光輻射的形式釋放能量，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法。較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量12.1分子發(fā)光分析概述第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為：

光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光

化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法

本章對分子熒光分析、磷光分析和化學(xué)發(fā)光分析這三種分子發(fā)光分析法進(jìn)行討論。熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、熒光和磷光的產(chǎn)生1.分子能級與電子激發(fā)態(tài)的多重度

分子能級比原子能級復(fù)雜；每個(gè)電子能級中包含一系列的振動能級和轉(zhuǎn)動能級。電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1，S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)，因此M=1（激發(fā)單重態(tài)S）或M=3（激發(fā)三重態(tài)T）。平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)。

12.2熒光和磷光分析基本原理第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日因此，電子激發(fā)態(tài)有：第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)

S1，S2，…

;第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)

T1，T2，…

。

激發(fā)過程：基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動能級)；

去活化過程：激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)。第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑（—熒光、磷光的產(chǎn)生）

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等去活化過程失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換系間竄躍振動弛豫無輻射躍遷

以速率最快，激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)。熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)最低振動能級→基態(tài)。外轉(zhuǎn)換第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日非輻射能量傳遞過程：

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱交換形式由高振動能級至低振動能級間的躍遷。這一失活過程極快（10-12s）。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同一多重態(tài)的兩個(gè)電子能級間的非輻射躍遷過程，如S2→S1，T2

→T1等

系間竄躍：不同多重態(tài)有重疊振動能級間非輻射躍遷。如S1→T1等。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道偶合進(jìn)行。

外轉(zhuǎn)換：溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱的形式釋放。常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)（或三重態(tài)）的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日輻射能量傳遞過程：

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(多為

S1→S0躍遷)，10-7～10-9s內(nèi)發(fā)射波長為2的熒光。通常發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；2>2>1

；光照停止后，光線也隨之很快地消失。

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(T1→S0躍遷)產(chǎn)生。先發(fā)生從激發(fā)單重態(tài)S1→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1的最低振動能級。發(fā)光速度很慢：10-4～100s；光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間；磷光的波長更長：磷>熒>激。

因此，熒光是單重-單重態(tài)的躍遷產(chǎn)生；磷光是三重-單重的躍遷產(chǎn)生。

第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

發(fā)射光譜（熒光或磷光光譜）

固定激發(fā)光的強(qiáng)度和波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜

固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。

兩種光譜可用于簽別熒光（磷光）物質(zhì)，亦可作為進(jìn)行熒光（磷光）物質(zhì)定量分析時(shí)選擇合適激發(fā)波長和測定波長的依據(jù)。第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日熒光光譜的基本特征a.Stokes位移

在溶液的熒光光譜中，熒光波長總是大于激發(fā)光的波長的現(xiàn)象。振動弛豫等消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如2)。

c.

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日鏡像規(guī)則的解釋:

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

三、熒光效率

分子能發(fā)射熒光取決于兩條件：（1）具有合適的結(jié)構(gòu)，能吸收激發(fā)光；（2）具有一定的熒光效率（熒光量子產(chǎn)率）。

熒光量子產(chǎn)率（）：

通常小于1，在0.1～1時(shí)具有分析應(yīng)用價(jià)值。熒光量子產(chǎn)率低，是由于激發(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能過程中除了熒光發(fā)射外，還存在多種非輻射躍遷與之競爭，而這些非輻射過程不僅與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與所處的環(huán)境密切相關(guān)。第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)相似，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。為什么？（1）具有共軛雙鍵體系的分子：*→熒光效率高。共軛雙鍵結(jié)構(gòu)有利于發(fā)熒光。共軛度高，熒光效率高并產(chǎn)生紅移。因此，絕大多數(shù)能發(fā)熒光的物質(zhì)為含有芳香環(huán)或雜環(huán)的化合物。（2）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少了系間竄躍至三重態(tài)及碰撞去活的可能性，有很強(qiáng)的熒光。（3）取代基的影響：第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日

取代基的影響分成三類：增強(qiáng)熒光的取代基

:-OH、-OR、-CN、-NR2等給電子基團(tuán)。由于基團(tuán)的n電子云與苯環(huán)上的軌道平行，p-共軛作用，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。減弱熒光的取代基：-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH

吸電子基團(tuán)，使熒光強(qiáng)度減弱。芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。影響不明顯的取代基：-NH3+、-SO3H等第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日(1)熒光定量關(guān)系式用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，透過光為It，并產(chǎn)生熒光If

。If=Ia=（I0-It）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0ItIf熒光強(qiáng)度檢測器If=（I0-I010-A）=I0

（1-10-A）It=I010-A將上式展開五、熒光定量分析原理第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日當(dāng)A﹤0.02時(shí)，方括號中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡化If=2.3I0A=2.3

I0bc當(dāng)入射光強(qiáng)度、試樣池長度不變時(shí)，對一給定稀溶液，I0、

、和b為常數(shù)，合并為K

If=KC

定量分析依據(jù)第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日濃度低時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，If=KC。濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系（有時(shí)C增大，If反而降低）。因?yàn)楣絒]中后面影響，且有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)或自吸效應(yīng)。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

①溶劑的影響一般來說，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長長移，熒光強(qiáng)度增大。

②溫度的影響——低溫下測定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對磷光影響更大。（2）環(huán)境對熒光強(qiáng)度的影響第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日③pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大。因?yàn)?，共軛酸堿對往往是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長。例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日可能測得由溶劑產(chǎn)生的散射光（包括瑞利、拉曼散射）。溶質(zhì)散射光有可能與熒光光譜重疊產(chǎn)生較嚴(yán)重的干擾（改變激發(fā)光的波長可避免）。⑤激發(fā)光照射的影響在激發(fā)光的照射下，有些熒光物質(zhì)的稀溶液容易發(fā)生光分解，引起熒光強(qiáng)度的急劇降低。采用強(qiáng)度較低的激發(fā)光，同時(shí)縮短測定時(shí)間，可減少熒光物質(zhì)的分解和由此引起的測量誤差。④各種散射光的影響

第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強(qiáng)度下降或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為猝滅劑。熒光猝滅的形式有多種。最常見的是碰撞猝滅——

M+激→M*M*+Q→M+Q+熱（無輻射）另外，某些猝滅劑分子與熒光分子發(fā)生作用，形成配合物或發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，也會引起熒光猝滅。⑥熒光猝滅第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。它們是定性分析的基礎(chǔ)。通常以發(fā)射光譜作為定性的依據(jù)，若不同物質(zhì)的發(fā)射光譜相似或重疊，激發(fā)光譜也可作為定性分析的另一依據(jù)。最常用的熒光定性方法是比較法：在相同的分析條件下，將待測物的熒光發(fā)射光譜或激發(fā)光譜與預(yù)期化合物的相應(yīng)光譜進(jìn)行比較，觀察光譜的特征峰波長及形態(tài)是否一致，加以判斷。六、熒光定性分析第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

測量熒光的儀器有熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)，它們主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、試樣池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測器通常成直角。基本流程圖：12.3熒光和磷光分析儀

第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日1、光源激發(fā)光源主要考慮其穩(wěn)定性和強(qiáng)度，一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度濾光片熒光計(jì)中，常使用高壓汞燈；熒光分光光度計(jì)中常用氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250～800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜；大多數(shù)熒光分光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。第一單色器作用：選擇所需的激發(fā)波長ex，用于激發(fā)試樣池內(nèi)的熒光物質(zhì)。第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用于分離出所需檢測的熒光發(fā)射波長em。第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日3、試樣池盛放測定溶液，通常是石英材料的方形或長方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測器把光信號轉(zhuǎn)化成電信號，放大，直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度。熒光光度計(jì)一般采用光電倍增管。

第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內(nèi)）室溫磷光技術(shù):以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子剛性，提高磷光量子效率。2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

即借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.熒光和磷光分析法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高

比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級；為什么？黑背景下檢測，通過增加入射光強(qiáng)度或增大熒光或磷光信號的放大倍數(shù)可提高靈敏度。（2）試樣量少（3）信息豐富

如激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、熒光效率、熒光和磷光壽命等）。缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍?。ū旧砟馨l(fā)熒光或磷光的物質(zhì)不多）。12.4熒光和磷光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日⑴痕量分析熒光和磷光分析法的靈敏度很高，特別適合于微量及痕量物質(zhì)分析通過一些間接的方法拓寬熒光分析法的應(yīng)用范圍●熒光試劑（也稱熒光探針）的使用；●利用熒光猝滅法測定氟、氰等能使熒光減弱的離子。多種熒光分析新技術(shù)的應(yīng)用●激光誘導(dǎo)熒光光譜分析法：激光光源、CCD等檢測器，大大提高分析靈敏度，甚至實(shí)現(xiàn)單分子檢測；●時(shí)間分辨熒光分析法：采用脈沖激光光源，延緩檢測時(shí)間，提高測定選擇性。2.熒光和磷光分析法的應(yīng)用第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日⑵聯(lián)用技術(shù)的檢測器高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離分析法的檢測器微型化分析方法如基因芯片、微流控芯片的檢測手段⑶分子結(jié)構(gòu)性能測定熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及熒光強(qiáng)度等熒光參數(shù)與分子結(jié)構(gòu)及其所處環(huán)境密切相關(guān)，能為分子結(jié)構(gòu)及分子間相互作用的研究提供有用信息。

目前：熒光分析法可用于測定多種無機(jī)物和有機(jī)物，在生物、醫(yī)藥和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域獲日益廣泛應(yīng)用；磷光分析法則主要用于有機(jī)化合物如藥物、多環(huán)芳烴以及石油產(chǎn)品的測定。第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、概述化學(xué)發(fā)光分析法是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象所建立的分析方法。化學(xué)發(fā)光光譜與對應(yīng)物質(zhì)的熒光光譜和磷光光譜十分相似，其主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能。12.5化學(xué)發(fā)光分析第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物（反應(yīng)產(chǎn)物）接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*；D*→D+h能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)，必須符合兩基本要求：化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的能量，又能被反應(yīng)產(chǎn)物分子吸收，使之處于激發(fā)態(tài)。

多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)。(2)吸收了化學(xué)能的激發(fā)態(tài)分子必須能釋放出光子或者能夠?qū)⑺哪芰哭D(zhuǎn)移給另一個(gè)分子，使該分子激發(fā)并以輻射光子的形式回到基態(tài)。

能夠發(fā)光的化合物多為有機(jī)化合物(芳香族)。第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型常見類型有：氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光⑴氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：指化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行。

如乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)甲醛而發(fā)光：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；是對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng·cm-3～1g·cm-3。第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日⑵液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

機(jī)理研究較多，應(yīng)用最多；如常見的發(fā)光物質(zhì)魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：該化學(xué)發(fā)藍(lán)光；反應(yīng)速率慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)，利用這一現(xiàn)象