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認(rèn)證信息

認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：何**（實(shí)名認(rèn)證）

IP屬地：廣東

IP屬地：廣東 上傳時(shí)間：2023-03-14 格式：PPT 頁(yè)數(shù)：21 大?。?.57MB 積分：15 舉報(bào) 版權(quán)申訴

實(shí)驗(yàn)四血清球蛋白的提純?cè)斀庋菔疚母瀹?dāng)前1頁(yè)，總共21頁(yè)。（優(yōu)選）實(shí)驗(yàn)四血清球蛋白的提純當(dāng)前2頁(yè)，總共21頁(yè)。請(qǐng)同學(xué)們清洗自己小組以下用品每個(gè)小組：層析柱（1支）比色板（2塊）玻璃棒（1支）離心管（1支）滴管（2支）燒杯（2個(gè)）試管（13支）注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每用一次清洗一次！當(dāng)前3頁(yè)，總共21頁(yè)。問(wèn)題1.血清蛋白質(zhì)的分類？

清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2.分離純化蛋白質(zhì)的方法？

電泳、透析及超濾、有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、免疫沉淀、層析、超速離心法等3.鹽析？層析？透析？

加入中性鹽破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素而使其沉淀（水化膜和電荷層）利用各組分理化性質(zhì)不同而分離（本實(shí)驗(yàn)是利用組分分子大小不同而分離）半透膜把大小分子分開(kāi)4.本實(shí)驗(yàn)鹽析所用硫酸銨飽和度是多少？

33%5.定性檢測(cè)蛋白質(zhì)和銨根離子的方法？

縮二脲反應(yīng)（紫紅色）或者與磺柳酸反應(yīng)生成白色沉淀納氏試劑（黃色或棕色）當(dāng)前4頁(yè)，總共21頁(yè)。一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握蛋白質(zhì)分離純化方法；2.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理；3.熟悉離心機(jī)的操作；4.熟悉蛋白質(zhì)、NH4+定性檢測(cè)的方法。當(dāng)前5頁(yè)，總共21頁(yè)。分離純化蛋白質(zhì)的方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析離心膜分離技術(shù)透析超濾當(dāng)前6頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用相同濃度的硫酸銨反復(fù)鹽析分離血清中的γ-球蛋白，再利用凝膠層析法除鹽，即可得到比較純的γ-球蛋白。

采用鹽析法分離清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物質(zhì)。當(dāng)前7頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理（一）鹽析（salting-out）定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使其從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用方法。當(dāng)前8頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理（二）透析（dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開(kāi)。透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過(guò)半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。其利用半透膜原理，通過(guò)擴(kuò)散、對(duì)流體內(nèi)各種有害以及多余的代謝廢物和過(guò)多的電解質(zhì)移出體外，達(dá)到凈化血液的目的，并且達(dá)到糾正水電解質(zhì)及酸堿平衡的目的。臨床應(yīng)用：血液透析

當(dāng)前9頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理（三）層析（chromatography）

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

按層析的原理不同可以分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析。（教程P25）

凝膠是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（分子大小不同）

小分子進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，流程長(zhǎng)，下移速度慢；大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中去，只能分布在顆粒的間隙中，所以流程短，向下移動(dòng)速度快。當(dāng)前10頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析法（根據(jù)分子大小差異而分離）當(dāng)前11頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理（四）離心（centrifuge）

離心技術(shù)是利用離心力，依據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)和浮力密度差異而進(jìn)行物質(zhì)的分離、濃縮和分析的一種技術(shù)。當(dāng)前12頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理離心操作要領(lǐng)1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時(shí)要按各種離心機(jī)操作說(shuō)明進(jìn)行。無(wú)蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。2、檢查離心管套筒是否完好、套筒內(nèi)有沒(méi)有軟膠墊或棉花。3、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物（配平）。4、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對(duì)稱放置。5、啟動(dòng)離心時(shí)離心速度由慢到快。當(dāng)前13頁(yè)，總共21頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)原理（五）檢測(cè)蛋白質(zhì)、NH4+的方法①檢測(cè)蛋白質(zhì)

縮二脲試劑：溶液顯紫紅色20％磺柳酸：有白色沉淀產(chǎn)生②檢測(cè)NH4+

納氏試劑：黃色或棕色當(dāng)前14頁(yè)，總共21頁(yè)。三.實(shí)驗(yàn)操作1、鹽析2、透析3、層析（脫鹽）4、檢測(cè)當(dāng)前15頁(yè)，總共21頁(yè)。1、鹽析取離心管一支加入血清2ml加入2mlPBS，搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4

2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘沉淀用1mlPBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4

0.5ml,搖勻傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白透析脫鹽靜置10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘用于配平用于配平樣品為豬血清當(dāng)前16頁(yè)，總共21頁(yè)。2、透析清蛋白

換水①透析袋剛放入水中時(shí),立即取袋外液體檢查有無(wú)NH4＋；②每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4＋透出的情況。①約0.5小時(shí)，檢查袋外液體的NH4＋情況；②取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20％磺柳酸1~2滴，觀察有無(wú)沉淀產(chǎn)生。水

水

當(dāng)前17頁(yè)，總共21頁(yè)。3、層析

12345678910②上樣γ－球蛋白，PBS10滴溶解

①裝柱

裝柱前用濾紙片堵住層析柱下口，防止下端玻紗堵塞葡聚糖凝膠G－25，柱高3/4~2/3柱長(zhǎng)流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑PBS10ml④收集20滴換一支試管當(dāng)前18頁(yè)，總共21頁(yè)。⑤

層析后洗脫液檢測(cè)每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測(cè)NH4+）,另一塊滴加縮二脲試劑（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。檢測(cè)蛋白及銨根離子不用滴管,避免污染,直接用試管傾倒。用“-”表示無(wú)現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺。⑥

回收凝膠當(dāng)前19頁(yè)，總共21頁(yè)。四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(用+-號(hào)表示，不寫顏色)表1.層析后洗脫液的顯色結(jié)果表2.透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號(hào)12345678910縮二脲試劑檢測(cè)后現(xiàn)象納氏試劑檢測(cè)后現(xiàn)象檢測(cè)次數(shù)123456試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn)象檢測(cè)人：時(shí)間：檢測(cè)人：時(shí)間：當(dāng)前20頁(yè)，總共21頁(yè)。五.注意事項(xiàng)１.正確使