多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第一頁，共十三頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)原理：PCR又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，Mg2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增數(shù)百萬倍。第二頁，共十三頁，2022年，8月28日１．DNA模板：反應(yīng)中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA純度較高，以增加反應(yīng)特異性。２．dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低。４．引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20堿基左右；G+C含量在40％－70％之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物３’端不能互補(bǔ)。５．Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性ＤＮＡ聚合酶，在95℃時(shí)30分鐘還有50％活力。說明第三頁，共十三頁，2022年，8月28日PCR過程示意圖第四頁，共十三頁，2022年，8月28日

二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑器材：臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf離心管，PCR小管

第五頁，共十三頁，2022年，8月28日試劑：

引物1，引物2，dNTPmix，10XPCRBuffer，TaqDNA聚合酶，EB，上樣緩沖液，marker，瓊脂糖，TBE緩沖液第六頁，共十三頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)步驟1：加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑（50ul體系）：

5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板

1ulTaqDNApolymerase

加水到總體積50ul第七頁，共十三頁，2022年，8月28日第八頁，共十三頁，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（對(duì)照組不加模板DNA）第九頁，共十三頁，2022年，8月28日2、按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（對(duì)于不同的PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件）94℃4分鐘94℃30秒51℃30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)72℃30秒72℃5分鐘4℃

第十頁，共十三頁，2022年，8月28日將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組放入PCR儀，按設(shè)定好的條件進(jìn)行擴(kuò)增第十一頁，共十三頁，2022年，8月28日3、擴(kuò)增結(jié)束后，取5ul產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結(jié)果PCR結(jié)果示意圖