產(chǎn)前分子診斷中需要注意的若干問(wèn)題鄭主任修改

產(chǎn)前分子診斷中需要注意的若干問(wèn)題鄭主任修改第1頁(yè)/共46頁(yè)產(chǎn)前診斷基本概念染色體核型分析NIPT/CNV巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)目錄第2頁(yè)/共46頁(yè)產(chǎn)前診斷，又稱宮內(nèi)診斷或出生前診斷，是對(duì)胚胎或胎兒是否患某種嚴(yán)重遺傳病或先天性畸形做出準(zhǔn)確診斷，以預(yù)防患兒的出生，是預(yù)防優(yōu)生學(xué)的重要組成部分。一、產(chǎn)前診斷的基本概念（一）產(chǎn)前診斷的定義第3頁(yè)/共46頁(yè)（一）產(chǎn)前診斷的意義1.優(yōu)生的重要措施，減少出生缺陷，提高全民素質(zhì)2.減輕家庭及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)3.阻斷致病基因在家族中的傳遞4.給孕婦有更大的空間和更多的選擇，對(duì)于高危孕婦同樣可以懷孕并且得到一個(gè)健康的小孩5.考慮要保存患病胎兒的孕婦，提供宮內(nèi)治療的可行性，提供良好的產(chǎn)前治療依據(jù)一、產(chǎn)前診斷的基本概念第4頁(yè)/共46頁(yè)篩查/

診斷篩查/診斷新生兒篩查篩查/診斷三級(jí)預(yù)防一級(jí)預(yù)防二級(jí)預(yù)防產(chǎn)前孕前植入前一、產(chǎn)前診斷的基本概念出生缺陷的三級(jí)預(yù)防第5頁(yè)/共46頁(yè)（三）產(chǎn)前診斷的指征

35歲以上的高齡孕婦羊水過(guò)多的孕婦有原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)史的孕婦具有遺傳病家族史，或系近親婚配的孕婦

X連鎖遺傳病基因攜帶者孕婦夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦夫婦之一有染色體畸變，特別是平衡易位攜帶者；夫婦核型雖正常，但生育過(guò)染色體病患兒的孕婦。夫婦之一有開(kāi)放性神經(jīng)管畸形，或是生育過(guò)這種畸形兒的孕婦夫婦之一有先天性代謝缺陷，或生育過(guò)這種患兒的孕婦一、產(chǎn)前診斷的基本概念第6頁(yè)/共46頁(yè)（四）產(chǎn)前診斷技術(shù)產(chǎn)前診斷技術(shù)包括兩方面：

取材技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)一、產(chǎn)前診斷的基本概念取材技術(shù)非侵入性：超聲波檢查母血胎兒細(xì)胞檢查

母血胎DNA/RNA檢查侵入性：絨毛取樣（孕7-9周）

羊膜腔穿刺（孕16-20周）臍帶穿刺（孕20-24周）

胎兒鏡檢查（孕18-20周）

第7頁(yè)/共46頁(yè)產(chǎn)前診斷檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用范圍一、產(chǎn)前診斷的基本概念第8頁(yè)/共46頁(yè)（一）應(yīng)選擇合適的時(shí)期和方法進(jìn)行染色體相關(guān)疾病的產(chǎn)前診斷

二、染色體核型分析孕期12-26+6w＜16w16-22w24-28w樣本外周血胎兒DNA絨毛羊水臍帶血方法NIPT核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS報(bào)告時(shí)間10個(gè)工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個(gè)工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個(gè)工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個(gè)工作日第9頁(yè)/共46頁(yè)染色體核型：46，X，del（X）（q25）

（二）典型案例分析A：女，36，體格檢查未見(jiàn)明顯異常二、染色體核型分析第10頁(yè)/共46頁(yè)染色體核型：45，XY，rob（13；13），-13，-13（二）典型案例分析B：男，50，身體健康二、染色體核型分析第11頁(yè)/共46頁(yè)（二）典型案例分析C：劉××，女，表型正常二、染色體核型分析45，XX，rob（14；21）（q10；q10）

第12頁(yè)/共46頁(yè)

？女方：28歲，孕3產(chǎn)0，胎停育2次，染色體核型：46XX,

t（3;5）(q25；p15)男方：核型正常孕20周，外院影像學(xué)排畸沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常二、染色體核型分析（三）多種方法平行使用A——3號(hào)和5號(hào)染色體平衡異位患者胎兒CNV檢測(cè)第13頁(yè)/共46頁(yè)愉快木偶綜合征（快樂(lè)天使綜合征）染色體異常：15q11-q13缺失發(fā)病率：1/40000臨床特征：小頭畸形、嚴(yán)重智力障礙、語(yǔ)言障礙、共濟(jì)失調(diào)步態(tài)、好動(dòng)、無(wú)意識(shí)發(fā)笑機(jī)制：母源性15q11-q13缺失或UBE3A基因突變二、染色體核型分析（三）多種方法交叉使用B——Angelman綜合征第14頁(yè)/共46頁(yè)患兒染色體核型未見(jiàn)異常二、染色體核型分析第15頁(yè)/共46頁(yè)FISH檢測(cè)結(jié)果示：15q11-q13缺失二、染色體核型分析第16頁(yè)/共46頁(yè)33歲孕婦，孕24周，46，XN，B超提示胎兒多處軟指標(biāo)異常，表現(xiàn)為胎兒頸后軟組織增厚，腸管回聲增強(qiáng)，單臍動(dòng)脈，對(duì)培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞進(jìn)行了高通量測(cè)序染色體異常檢測(cè)，結(jié)果顯示：存在1處染色體結(jié)構(gòu)異常：22q11.21-22q11.23存在2.3M缺失，該片段包UBE2L3,YDJC,CCDC116等幾十個(gè)基因或基因片段。22q11.21-22q11.23區(qū)域的片段缺失與22q11.2缺失綜合征（22q11.2deletionsyndrome）有關(guān)，臨床表現(xiàn)為身材矮小，面部異常，智力障礙等。二、染色體核型分析（三）多種方法交叉使用——核型正常，B超異常的染色體因素深度排查第17頁(yè)/共46頁(yè)（一）NIPT結(jié)果分析？

結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性真陽(yáng)性假陽(yáng)性假陰性拒絕隨訪/失聯(lián)21三體0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%性染色體異常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNV第18頁(yè)/共46頁(yè)NIPT的假陽(yáng)性胎兒染色體核型分型重視知情同意2.NIPT的假陰性重視影像學(xué)的檢查？

結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性真陽(yáng)性假陽(yáng)性假陰性拒絕隨訪或失聯(lián)21三體0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%（個(gè)別拒絕隨訪）性染色體異常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNV第19頁(yè)/共46頁(yè)胎盤(pán)嵌合-假陽(yáng)性發(fā)生率約1/1000NewEnglandJournalofMedicine，371;6577-578（2014）第20頁(yè)/共46頁(yè)胎盤(pán)嵌合-假陰性2117周NIPT檢測(cè)結(jié)果：45，XO；羊穿結(jié)果：47，XX，+18MolecularCytogenetics.

2014,7:48第21頁(yè)/共46頁(yè)假陰性原因排查過(guò)程原因排查過(guò)程

取樣：母親血細(xì)胞DNA、胎兒組織、胎盤(pán)組織

分析方法：測(cè)序、FISH和CMA母親核型正常46，XX（排除母體干擾）NIPT流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤(pán)組織：45,X(~60%)

andT18(嵌合率~30%)FISH流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤(pán)組織：45,X

cells(67%,62/92)andT18cells(30%,28/92)SNP-array流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤(pán)組織：45,Xcells(67%)andT18cells(50%)胎兒為100%濃度的47，XX，+18胎盤(pán)嵌合，大部分細(xì)胞為45,XO;少量細(xì)胞為47，XX，+18

第22頁(yè)/共46頁(yè)母體自身染色體異常干擾樣本ID實(shí)驗(yàn)編號(hào)chr13chr18chr21180100721-0.4263.713-1.256180100722-0.5763.2290.366180100723-1.1094.207-0.676180100724-1.0152.816-0.631孕婦年齡30歲，孕27周，NIPT多次上機(jī)均提示T18高風(fēng)險(xiǎn)。胎兒B超未發(fā)現(xiàn)任何異常，羊穿顯示為46，XY。后來(lái)CNV分析顯示為母體18號(hào)染色體短臂微重復(fù)所致的假陽(yáng)性。第23頁(yè)/共46頁(yè)影響無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查的因素母體染色體核型異常：母體的實(shí)質(zhì)腫瘤：發(fā)生內(nèi)在基因組成改變的狀況胎盤(pán)嵌合體（confinedplacentalmosaicism，CPM）染色體單親二倍體（uni-parentaldisomy,UPD）胎兒嵌合孿生兒消失現(xiàn)象胎兒游離DNA濃度太低：實(shí)驗(yàn)室操作錯(cuò)誤

第24頁(yè)/共46頁(yè)孕周（>12W）妊娠情況（單胎/雙胎/多胎?）既往病史

如異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、免疫治療、腫瘤、病毒感染等可能引入外源DNA或改變胎兒游離DNA的組成和比例，影響檢測(cè)結(jié)果）樣本狀態(tài)及運(yùn)輸

溶血？是否及時(shí)采用冷鏈運(yùn)輸知情同意非常重要?。》治銮百|(zhì)量控制第25頁(yè)/共46頁(yè)分析中質(zhì)量控制產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制（如溫濕度，穩(wěn)壓或不間斷電源）儀器設(shè)備及管理（PCR儀、離心機(jī)、加樣器等定期維護(hù)并校準(zhǔn)）人員資質(zhì)及培訓(xùn)第26頁(yè)/共46頁(yè)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測(cè)序技術(shù)）緩沖間測(cè)序區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向文庫(kù)擴(kuò)增與檢測(cè)區(qū)標(biāo)本與文庫(kù)制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)第27頁(yè)/共46頁(yè)胎兒游離DNA濃度測(cè)定方法

多重SNP法(>4%)

Y染色體法文庫(kù)構(gòu)建--DNA片段篩選盡可能消除母體基因組DNA的背景干擾，富集游離DNA（cfDNA）分析中質(zhì)控第28頁(yè)/共46頁(yè)準(zhǔn)確的文庫(kù)質(zhì)檢是后續(xù)獲得高質(zhì)量、均一數(shù)據(jù)的關(guān)鍵分析中質(zhì)量控制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法文庫(kù)濃度測(cè)定：1.qPCR法/Qubit對(duì)DNA濃度準(zhǔn)確定量；2.Aiglent2100對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行定性2100檢測(cè)結(jié)果第29頁(yè)/共46頁(yè)分析后質(zhì)量控制

審核項(xiàng)數(shù)據(jù)要求異常處理原始數(shù)據(jù)量（M）≥3.5M重上機(jī)Q30(1000個(gè)堿基中的錯(cuò)誤率)≤85重上機(jī)Uniquereads數(shù)量（M）≥2M重上機(jī)比對(duì)率≥62.5%重建庫(kù)Duplication率≤15%重建庫(kù)樣本GC含量EDTA:

38%-42%Ardent:

35%-42%重建庫(kù)分析完成后，首先查看原始數(shù)據(jù)量，Q30，對(duì)照品結(jié)果和GC偏移度是否通過(guò)等等..下機(jī)樣本數(shù)據(jù)要求第30頁(yè)/共46頁(yè)（二）CNV結(jié)果的解讀發(fā)現(xiàn)明確致病的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）未檢出染色體非整倍體或100kb以上已知明確致病的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）其他類型100Kb以上的拷貝數(shù)變異（CNVs）

數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有記錄的

數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄為多態(tài)性的二、NIPT/CNV第31頁(yè)/共46頁(yè)CNV結(jié)果分析樣本類型臨床意義沒(méi)有檢出致病性CNV意義不明CNV多態(tài)性總例數(shù)外周血43110761羊水0241126流產(chǎn)物34115353臍血10001總數(shù)7836161114二、NIPT/CNV第32頁(yè)/共46頁(yè)特別關(guān)注?。。〉?3頁(yè)/共46頁(yè)巨細(xì)胞病毒感染的現(xiàn)況胎兒先天性巨細(xì)胞病毒感染的后果巨細(xì)胞病毒的血清學(xué)檢測(cè)巨細(xì)胞病毒的分子檢測(cè)重視孕婦和新生兒的巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)四、巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)第34頁(yè)/共46頁(yè)1.巨細(xì)胞病毒感染現(xiàn)況巨細(xì)胞病毒血清學(xué)檢測(cè)

IgG和IgM滴度

IgG親和力四、巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)第35頁(yè)/共46頁(yè)1.巨細(xì)胞病毒感染現(xiàn)況IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性率：>90%IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率（4.5個(gè)月）

產(chǎn)科+生殖科：11/1038=0.0106兒科：41/940=0.0436

四、巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)圍產(chǎn)期感染宮內(nèi)感染(先天性CMV感染)第36頁(yè)/共46頁(yè)2.胎兒巨細(xì)胞病毒感染我國(guó)育齡婦女幾乎均為巨細(xì)胞病毒抗體陽(yáng)性；巨細(xì)胞病毒的先天性感染是兒童感覺(jué)神經(jīng)性耳聾最主要的病因，早期診斷價(jià)值高；抗體陽(yáng)性孕婦對(duì)巨細(xì)胞病毒的垂直傳播并不低于孕期胎兒的原發(fā)性感染。四、巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)第37頁(yè)/共46頁(yè)垂直傳播：病毒血癥孕婦的垂直傳播率高達(dá)44%不良妊娠結(jié)局：死胎90%出生時(shí)沒(méi)有癥狀，后遺癥13%10%出生時(shí)有癥狀，60%的后遺癥：聽(tīng)力、視力、智力，腦發(fā)育和肝脾、血液系統(tǒng)等（7歲前發(fā)生）羊水的病毒載量與垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)和后遺癥的癥狀相關(guān)原發(fā)性感染復(fù)發(fā)性感染潛伏在體內(nèi)的CMV被重新激活再次感染外源性其他血清型的病原體。第38頁(yè)/共46頁(yè)如果妊娠前的免疫狀態(tài)未知，診斷基于特異性IgM抗體，特異性IgM抗體陽(yáng)性的孕婦只有部分為原發(fā)性感染復(fù)發(fā)性感染孕婦中也可檢出IgM抗體，并且原發(fā)性感染數(shù)月后血清中還可檢出IgM抗體IgM抗體陽(yáng)性可能還包括IgM抗體假陽(yáng)性者抗體：間隔3～4周后重復(fù)測(cè)定診斷依據(jù)包括血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(初次血清抗體陰性的孕婦出現(xiàn)特異性IgG抗體)，或者IgG抗體滴度增加4倍IgG抗體親和力測(cè)定：親和力指數(shù)<30％，提示孕婦CMV感染為近2-4個(gè)月內(nèi)的原發(fā)性感染。IgM抗體陽(yáng)性伴隨低親和力IgG抗體在診斷母體原發(fā)性CMV感染方面優(yōu)于