慶大霉素的生產(chǎn)工藝課件

氨基糖苷類

慶大霉素呂美珍裴聰趙煥平王佳佳任永成2012.5.24慶大霉素一.氨基糖苷類的總述二.慶大霉素1.概述-結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2.藥代動力學(xué)3.制備原理4.工藝路線5.工藝過程6.代謝調(diào)控7.最新成果氨基糖苷類的總述氨基糖苷類抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素。有來自鏈霉菌的鏈霉素等、來自小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類，還有阿米卡星等半合成氨基糖苷類。雖然大多數(shù)抑制微生物蛋白質(zhì)合成的抗生素為抑菌藥，但氨基糖苷類抗生素卻可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。

氨基糖苷類抗生素可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。其殺菌作用具有如下特點：1.殺菌作用呈濃度依賴性。2.僅對需氧菌有效，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌作用強。3.具有明顯的抗生素后效應(yīng)。4.具有首次接觸效應(yīng)。5.在堿性環(huán)境中抗菌活性增強。

慶大霉素是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素,是由22脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成的多組分混合物,并以C族復(fù)合物為主。22脫氧鏈霉胺分別在4、6位上通過苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺,因絳紅糖胺C6c上的甲基化程度不同,形成了C1、C2、C1a3個主要組分,其結(jié)構(gòu)如圖所示。這3個組分中,C1、C2、C1a的療效和毒性互不相同:C1組分毒副作用最小且不易產(chǎn)生耐藥性,但療效稍差;C2和C1a組分療效高,但毒性較大且容易產(chǎn)生耐藥性。

性狀：常用其硫酸鹽，為白色或類白色結(jié)晶性粉末；無臭；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中不溶。藥代動力學(xué)一.功能主治對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、克雷白桿菌、奇異變形桿菌、某些吲哚變形桿菌、綠膿桿菌、某些奈瑟菌、某些無色素沙雷桿菌和志賀菌等革蘭陰性菌有抗菌作用。革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌對該品敏感；鏈球菌對該品耐藥。厭氧菌、結(jié)核桿菌、立克次體、病毒和真菌亦對該品耐藥。近年來，由于該品的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株逐漸增多，綠膿桿菌、克雷白桿菌和沙雷桿菌、吲哚陽性變形桿菌對該品的耐藥率甚高。對金葡菌及大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，奇異變形桿菌，綠膿桿菌等G－菌作用較強。適用于敏感細菌所致的新生兒膿毒癥、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（包括腦膜炎）、尿路生殖系統(tǒng)感染、呼吸道感染、胃腸道感染（包括腹膜炎）、膽道感染、皮膚、骨骼、中耳炎、鼻竇炎、軟組織感染（包括燒傷）、李斯特菌病。三.動力學(xué)肌注后吸收迅速而完全。局部沖洗或局部應(yīng)用后亦可經(jīng)身體表面吸收一定量。吸收后主要分布于細胞外液，其中5～15%再分布到組織中，在腎皮質(zhì)細胞中積蓄，該品可穿過胎盤分布容積為0.2～0.25L/kg(0.06～0.63L/kg)。尿液中藥物濃度高。支氣管分泌物、腦脊液、蛛網(wǎng)膜下腔、眼組織以及房水中含藥量少。蛋白結(jié)合率低或很低。肌內(nèi)注射或靜脈滴注后30～60分鐘血藥濃度達峰值，成人肌注后的血藥峰濃度(μg/ml)一般為按體重肌注劑量(mg/kg)的4倍，靜滴完畢后可達4～6μg/ml，嬰兒單次給藥2.5mg/kg后可達3～6μg/ml；發(fā)熱或大面積燒傷患者，血藥濃度可能有所降低。T1/2成人為2～3小時，腎功能衰退者40～50小時。發(fā)熱、貧血、嚴重?zé)齻颊呋蚝嫌敏绕S青霉素的患者T1/2可能縮短；但在婦科、外科及燒傷的不同患者間有很大差異。小兒T1/2為5～l1.5小時，體重輕的T1/2較長。該品在體內(nèi)不代謝，經(jīng)腎小球濾過排出，尿中濃度可超過100μg/ml，24小時內(nèi)排出50～93%。新生兒出生3天以內(nèi)者，給藥12小時內(nèi)排出10%；新生兒出生5～40天者給藥12小時內(nèi)排出40%。血液透析與腹膜透析可從血液中清除相當(dāng)藥量，使T1/2顯著縮短。

四.適合癥狀①該品適用于綠膿桿菌、變形桿菌(吲哚陽性和陰性)、大腸桿菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、枸櫞酸桿菌屬以及葡萄球菌(包括耐青霉素(G)與耐甲氧西林菌株)所致的新生兒膿毒癥、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(包括腦膜炎)、尿路生殖系統(tǒng)感染、呼吸道感染、胃腸道感染(包括腹膜炎)、膽道感染、皮膚、骨骼、中耳炎、鼻竇炎；軟組織感染(包括燒傷)、李斯特菌?。虎谠撈酚糜诰G膿桿菌或葡萄球菌所嚴重中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時(腦膜炎、腦室炎)，可同時用該品鞘內(nèi)注射作為輔助治療；③該品不適用于單純性尿路感染初治，除非病原菌對其他毒性較低的抗菌藥物不敏感，該品對鏈球菌中的多數(shù)菌種(尤其D組)、肺炎球菌和厭氧菌(如類桿菌屬或梭狀芽胞桿菌屬)無效；④該品口服可用于腸道感染或結(jié)腸手術(shù)前準(zhǔn)備，也可用該品肌注合并克林霉素或甲硝唑以減少結(jié)腸手術(shù)后感染率。五.使用劑量成人肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次80mg(8萬單位)，一日2—3次，間隔8小時。或按體重1一1.7mg/kg(以慶大霉素計，下同)。每8小時1次；或按體重0.75一1.25mg/kg，每6小時1次，共7一10日。小兒按體重每日3—5mg/kg，分2—3次給藥。血液透析后，可根據(jù)感染嚴重程度，成人按體重補給一次劑量1—1.7mg/kg；小兒按體重補給2—2.5mg/kg。

(5)給予首次飽和劑量(1一2mg/kg)后，有腎功能不全，前庭功能或聽力減退的患者所用維持量應(yīng)酌減：劑量不變，延長給藥間隔時間；或給藥間期不變，每次劑量減少或停用慶大霉素，其維持量可按下式計算：①延長給藥間期(小時)，每次劑量不變(1一2mg/kg)，給藥間期=患者血肌酐值(mg/100ml)×8或②減少維持劑量，每8小時給藥一次：每次劑量=患者體重（kg）×常規(guī)用量（mg/kg）/患者血肌酐值(mg/100ml)。由于慶大霉素在體內(nèi)不代謝，主要經(jīng)尿排出，因此腎功能減退的患者中可能引起藥物積聚達中毒濃度。不良反應(yīng)(1)曾有報道慶大霉素全身應(yīng)用合并鞘內(nèi)注射時引起腿部抽搐、皮疹、發(fā)熱和全身痙攣等。慶大霉素引起腎功能減退的發(fā)生率較妥布霉素為高。大劑量用藥容易導(dǎo)致水腫(2)發(fā)生率較多者有聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感(耳毒性)、血尿、排尿次數(shù)顯著減少或尿量減少、食欲減退、極度口渴(腎毒性)、步履不穩(wěn)、眩暈(耳毒性，影響前庭；腎毒性)。發(fā)生率較低者有呼吸困難、嗜睡、極度軟弱無力(神經(jīng)肌肉阻滯或腎毒性)。(3)停藥后如發(fā)生聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感，需引起注意。不良反應(yīng)與卡那霉素進近似，用量小時反應(yīng)較輕.如用量大，療程長，偶見腸道菌群紊亂，一旦出現(xiàn)即停藥，可恢復(fù)正常.可有白細胞減少，聽力及腎損害.個別病例口周、面部和四肢皮膚發(fā)麻，眩暈,耳鳴.偶有過敏性休克，主要癥狀為呼吸道阻塞及循環(huán)障礙、半數(shù)以上病例經(jīng)搶救無效而死亡，故有人認為該品的最嚴重的不良反應(yīng)為速發(fā)型過敏性休克.可引起羅姆伯格氏癥(閉目難立，暗處和洗臉時站不穩(wěn))中毒癥狀。耐藥機制1、產(chǎn)生鈍化酶：如磷酸化酶、腺苷化酶、乙?；?。2、細胞膜通透性下降。3、修飾靶蛋白（p10蛋白）。缺乏主動轉(zhuǎn)運功能：如厭氧菌對氨基糖苷類的耐藥性。硫酸慶大霉素工藝流程工藝過程(一)菌種生產(chǎn)中國內(nèi)常用絳紅小單孢菌，國外常用棘孢小單孢菌、橄攬星小單孢菌。對菌種進行誘變選育，采用的方法有紫外線、離子輻射、N離子注入、微波處理、DES化學(xué)法等。另外，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及在微生物基因組計劃的推動下，國內(nèi)外對放線菌的抗生素合成、調(diào)控和轉(zhuǎn)運基因已經(jīng)進行了大量卓有成效的研究，因此，通過對慶大霉素生物合成基因的克隆與轉(zhuǎn)移來提高其增產(chǎn)是很有發(fā)展前景的。孢子萌發(fā)的影響條件1、p H值：當(dāng)小單孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH7.0時,菌絲生長快,慶大霉素合成起步早,產(chǎn)抗期延長.同樣是5天的周期,而它的發(fā)酵水平最高.說明慶大霉素代謝合成最適pH值比孢子萌發(fā)pH值略高.2、溫度的影響：溫度是孢子萌發(fā)的重要條件,它影響萌發(fā)的速度和百分率.菌株培養(yǎng)溫度由30→34℃時,萌發(fā)率相差幾倍.當(dāng)溫度由34→36℃,大部份菌株發(fā)芽率達最大值,最適溫度為36℃.3、溶氧對孢子萌發(fā)的影響：溶氧對孢子萌發(fā)也是不可缺少的因素.振蕩培養(yǎng)12h的萌發(fā)率相當(dāng)于靜止培養(yǎng)17h的狀況.以相同的培養(yǎng)時間,前者比后者萌發(fā)率提高30%～45%.振蕩培養(yǎng)17h,萌發(fā)率高達41%～60%.4、孢子的密度與萌發(fā)的關(guān)系：當(dāng)?shù)攘颗囵B(yǎng)液中接入不同量的孢子時,萌發(fā)率隨著密度的增加而相應(yīng)地降低.這可能與斜面孢子在貯藏過程中菌絲自溶釋放出某些物質(zhì)濃度過大而對孢子萌發(fā)具有抑制作用有關(guān).同時存在高密度孢子萌發(fā)所需營養(yǎng)顯得不足.5、生長因子對孢子萌發(fā)的影響：出對孢子萌發(fā)最有效的生化因子甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸,經(jīng)雙因子組合試驗,孢子萌發(fā)率最高可達74.2%,由此證明絳紅色小單孢菌孢子萌發(fā)率低的主要因素可能與缺乏某些氨基酸及一些生長因素這些簡單營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān).2.種子的制備實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程上歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段發(fā)酵培養(yǎng)基查閱國內(nèi)外關(guān)于慶大霉素生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基，歸納起來有二十多種，選擇其中十二種進行研究，按主次順序排列如下：黃豆餅粉>蛋白胨>(NH4)2SO+>淀粉>玉米粉>CaCO3>魚粉>KNO3>豆油>COOL2>合成消沫劑>葡萄糖。發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖0.5,玉米淀粉5.5,玉米粉1,黃豆餅粉4,蛋白胨0.3,魚粉0.5,CaCO30.6,(NH4)2SO40.1,C0Cl28r/mlpH7.2.工藝提取采用732陽離子交換樹脂，利用離子交換法從發(fā)酵液中提取慶大霉素。最優(yōu)的提取條件為:發(fā)酵液pH2～3，吸附時間2h，解吸劑濃度5%，解吸劑流速0．4mL/min。經(jīng)HPLC測定，發(fā)酵液通過離子交換法分離提取后，慶大霉素純度為92．5%。離子交換法適用于慶大霉素發(fā)酵液的分離提取，提取液純度達到藥物分析的要求。代謝調(diào)控Thepromoters(aminoacids)ofbiosynthesisgentamicinwerescreenedoutbytheorthogonaldesigninthecourseofproductinggentamicinbyMicromonosporapurpurea.Someamountofglycine,lysine,tyrosine,methioninewasaddedtotheoriginalmediuminflaskandincubatedat36ontherotaryshaker220r/minfor96h.Itwaspropitioustobiosynthesizegentamicinandincreasedtheyieldofgentamicinover30%thancontrolgroup;theproductionrateofgentamicinwasincreasedby40%。在絳紅色小單孢菌(Micromonosporapurpurea)產(chǎn)生慶大霉素的過程中,運用正交設(shè)計篩選慶大霉素(gentamicin)生物合成促進劑-氨基酸.經(jīng)搖瓶實驗證明,在原培養(yǎng)基中添加一定量的甘氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蛋氨酸,在旋轉(zhuǎn)搖床上220r/min36培養(yǎng)96h,有利于生物合成慶大霉素,較對照產(chǎn)量可增加30%左右,產(chǎn)素率提高40%左右.添加氨基酸后其在微生物細胞內(nèi)的作用機理往往可歸納為幾種類型:（1）氨基酸脫去氨基后形成的碳骨架通過特定的代謝途徑進入TCA循環(huán),增加了TCA循環(huán)的代謝通量,從而提高了細胞的能量水平,促進了細胞生長和代謝產(chǎn)物合成,因此小單孢菌菌絲粗壯,細胞染色深,發(fā)酵液粘稠,縮短了生長期,提前進入產(chǎn)素期.（2）由于氨基酸是一種兩性離子,具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)生理pH值的功能，并能促使pH最大限度地滿足細胞生理功能的需要.本研究證明新方法pH值明顯高于原工藝,pH偏堿性更有利于絳紅色小單孢菌細胞的代謝和產(chǎn)素.（3）抑制或激活相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,從而促進目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。大量實驗說明主要是激活初級代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性,從而促使在整個發(fā)酵過程中細胞代謝旺盛,周期縮短,產(chǎn)素率得到明顯提高.（4）氨基酸通過特定代謝途徑產(chǎn)生目的代謝途徑中所需的輔酶或中間代謝物包括前體物。新方法所用的蛋氨酸(甲硫氨酸)無論對于原核細胞還是真核細胞的代謝都是重要的中間代謝物質(zhì).在生物體中蛋氨酸(甲硫氨酸)是通過5-腺苷甲硫氨酸合成酶消耗ATP,使甲硫氨酸腺苷化而合成腺苷甲硫氨酸(SAM).S