細胞免疫熒光技術

細胞免疫熒光技術當前1頁，總共17頁。實驗目的掌握免疫熒光技術的基本原理熟悉細胞免疫熒光技術的方法了解在免疫細胞化學技術中如何獲得好的實驗結果當前2頁，總共17頁。實驗原理原位檢測抗原抗體特異反應間接法間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Hela細胞Vinculin當前3頁，總共17頁。實驗用品試劑：固定液：4%PFA細胞通透：0.2%TritonX封閉試劑：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體二抗:AlexaFluor555標記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：PH7.4材料：Hela細胞細胞培養(yǎng)皿儀器：熒光顯微鏡當前4頁，總共17頁。實驗步驟一，細胞制備和細胞固定將細胞鋪在24孔板中將細胞培養(yǎng)至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗滌PBS洗滌當前5頁，總共17頁。實驗步驟二，細胞免疫熒光ICC染色0.2%TritonX處理5min封閉室溫30min4℃過夜37℃1-2小時37℃5-10min熒光顯微鏡觀察加入一抗加入二抗加入DAPI復染PBS洗滌PBS洗滌PBS洗滌當前6頁，總共17頁。實驗結果三，觀察

humanHeLacells當前7頁，總共17頁。實驗中應注意的問題

細胞不要鋪的過密:60-70%防止細胞污染

固定時間不要太長,一般10-30min

TrionX處理時間不宜過長，膜蛋白可不必處理選擇合適的封閉液二抗孵育后,一定要洗干凈必要時用恒溫搖床搖洗當前8頁，總共17頁。

1.免疫熒光技術

2.免疫酶技術

3.免疫親和技術

4.膠體金技術

標記物

使抗體或抗原抗體復合物在各種顯微鏡下可見的物質免疫細胞化學技術當前9頁，總共17頁。免疫細胞化學技術注意事項選擇合適的方法材料要留好選擇抗體選擇標記酶封閉液的選擇設定對照實驗當前10頁，總共17頁。思考題檢測Hela細胞中蛋白A定位情況，思考應選擇什么方法，用什么儀器觀察？A當前11頁，總共17頁。疑難解答一，缺乏染色

可能的原因無抗原抗體失效固定不充分過度固定抗原修復無效不兼容的二抗和一抗漏用試劑或未按正確的順序加入試劑相應的措施用原位雜交方法檢測蛋白表達按說明書儲存抗體;分裝抗體;避免反復凍融增加固定時間或改用不同的固定劑減少固定時間;抗原修復增加修復時間或更換修復液使用可以與一抗結合的二抗重復染色并確定使用的試劑和加入的順序當前12頁，總共17頁。二，高背景當前13頁，總共17頁。

可能的原因一抗或二抗的濃度過高一抗和/或二抗與組織的非特異性結合組織過于干燥試劑粘附在舊的或未制備好的玻片上相應的措施預實驗摸索最佳濃度一抗孵育前封閉(最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進行實驗當前14頁，總共17頁。三，細胞/組織的形態(tài)被破壞當前15頁，總共17頁。

可能的原因抗原修復方法過于劇烈組織切片從玻片上脫落組織切片撕裂或褶皺,切片下有氣泡組織形態(tài)難以分辨組織固定不充分,自發(fā)裂解

相應的措施預實驗摸索合適的修復條件增加固定時間;烤片;使用新鮮準備的帶有充足電荷的玻片使用鋒利的刀片;分析時避開受損的區(qū)域切片薄一些;冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水及時固定;增加固定時間;提高固定劑/組織的比例;

將組織切得較小當前16頁，總共17頁。四，染色不正確

可能的原因固定方法對于抗原不合適抗原修復方法不合適沒有及時固定引起抗原