Westernblotting 技術(shù) 實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用

/Westernblotting總蛋白的提取收集小鼠組織或是細(xì)胞入1.5ml離心管中。每管加一定量的蛋白裂解液。注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白濃度達(dá)到10g/l左右為佳。用勻漿棒進(jìn)行勻漿（冰中進(jìn)行）。加入一定量的PMSF，使其終濃度為1mM。冰中放置30~60min。4℃、12000rpm離心30min，上清即為總蛋白。可放-30蛋白濃度的測(cè)定（BCA試劑盒）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的整理配不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（見(jiàn)表2-1）表2-1BSA各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的配制Table2.1PreparationofstandardsolutionwithdifferentBSAconcentration10mMTris-HCl（pH=7.5）FinalBSAConcentrationA700μl100μlBSA250μg/μlB400μl400μlA液125μg/μlC450μl300μlB液50μg/μlD400μl400μlC液25μg/μlE400μl100μlD液5μg/μlF400μl0μg/μl按50：1配SolutionA：SolutionB混合液，每個(gè)樣本需2ml。在每個(gè)試管中加入2mlSolutionA：SolutionB混合液以及0.1ml樣本，于60℃測(cè)OD562nm，空白對(duì)照為10mMTris-HCl（pH=7.5），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)樣品濃度用10mMTris-HCl（pH=7.5）稀釋樣品100倍。加2mlSolutionA：SolutionB混合液+0.1ml稀釋樣本，60℃測(cè)OD562nm。調(diào)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，讀出對(duì)應(yīng)濃度值，再乘以100，即為該樣品濃度。SDS電泳PAGE膠的制備（5%濃縮膠、10%分離膠）。10%分離膠溶液的配制30%Acr-Bis（29：1） 1.32ml1.5MTris-HCl(pH=8.8) 1ml20%SDS 20μl加水至4ml，輕輕混勻，避免氣泡產(chǎn)生。倒膠前加入20μl的10%過(guò)硫酸銨（APS）以及2μl的TEMED，輕輕混勻，緩慢注入兩玻璃板之間（液面最高處應(yīng)在梳子下方約0.5cm處）。然后緩慢加入1ml去離子水，37℃5%濃縮膠溶液的配制30%Acr-Bis（29：1） 0.34ml0.5MTris-HCl(pH=6.8) 0.5ml20%SDS 10μl加水至2ml，輕輕混勻，避免氣泡產(chǎn)生。倒膠前加入10μl的10%APS以及2μl的TEMED，輕輕混勻，緩慢注入兩玻璃板之間分離膠的上方，加滿(mǎn)，插入梳子。室溫放置待其凝固。蛋白樣本制備取20~100μg的總蛋白，加入同樣體積的2×蛋白上樣緩沖液，于沸水中煮5min，然后6000rmp、2min，取上清待用。電泳把做好的濃縮-分離膠板放入電泳裝置中，加入1×蛋白電泳緩沖液，輕輕拔出梳子。把蛋白樣本加入加樣孔。電泳：濃縮膠70V，分離膠140V，直至溴酚藍(lán)遷移至底部，停止電泳。電轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備好與膠大小一致的硝酸纖維素膜一張、兩張相應(yīng)大小的濾紙，將其與纖維墊放入1×蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15~60min。按照纖維墊、濾紙、膠、膜、濾紙、纖維墊的順序作好轉(zhuǎn)膜三明治，濾紙、膠、膜、濾紙各層中要用玻棒趕盡氣泡，然后放入轉(zhuǎn)膜裝置中。注意放置的次序：負(fù)極（黑孔板）—→纖維墊—→濾紙—→膠—→膜—→濾紙—→纖維墊—→正極（紅孔板）。于4℃轉(zhuǎn)膜完畢后，取出膜，放入麗春紅染液中染色5min，觀察轉(zhuǎn)膜效果。將膜于清水中沖洗，洗去麗春紅，放入PBS，待用。封閉將膜放入5%脫脂奶粉（PBS配制）中，于脫色搖床中室溫緩慢搖1h。雜交用PBS或是封閉液稀釋一抗：Rabbit-anti-Dnaic2（1：2）、Rabbit-anti-DNAI2（1：1000）、Mouse-anti-myc（1：1000）、Mouse-anti-β-tublin（1：1000）、Mouse-anti-Stat3（1：100）、Rabbit-anti-p-Stat3（1：100）或是Mouse-anti-PCNA（1：100），于37℃搖2~3h或是4用含1%Tween-20的PBS洗膜兩次，每次5min。加入用PBS或是封閉液稀釋的相應(yīng)的二抗：HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：1000）、HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：2000），于37℃ECL顯色（ECL顯色試劑盒）A液：B液=1：1混合，加到膜上，封好。壓片曝光1~5min。顯影、定影，用水沖洗膠片、晾干。

蛋白裂解貯存液：1MTris-HCl(pH=7.5) 5mlTritonX-100 1ml0.5MEDTA(pH=8.0) 1ml加水至100ml，用濾紙過(guò)濾，4℃保存。用時(shí)加入leupeptin（終濃度為10μg/ml）及aprotinin（終濃度為10μg/ml）蛋白酶抑制劑配成蛋白裂解液。100mMPMSF：PMSF 17.42mg加無(wú)水乙醇至1ml，-20℃保存。1.5MTris-HCl（pH=8.8）:Tris 堿 90.8g去離子水 400ml溶解后，加濃鹽酸調(diào)pH至8.8，然后定容至500ml。0.5MTris-HCl（pH=6.8）:Tris 堿 30.3g去離子水 400ml溶解后，加濃鹽酸調(diào)pH至6.8，然后定容至500ml。10%APS：APS 0.1g加去離子水至1ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。2×蛋白上樣緩沖液：0.5MTris-HCl(pH=6.8) 1.25ml甘油 2.5ml20%SDS 1ml0.5%溴酚藍(lán) 0.2ml加去離子水至10ml，-30℃保存。使用前加入β-巰基乙醇（終濃度為5%）。10×蛋白電泳緩沖液：Tris堿 30.3g甘氨酸 144gSDS 1%w/v加去離子水至1L。使用時(shí)稀釋成1×電泳緩沖液。1×蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris堿 3.03g甘氨酸 14.4g甲醇 200ml