觀察脊髓CCR-8表觀遺傳調(diào)控及其對痛覺敏化的影響,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

觀察脊髓CCR-8表觀遺傳調(diào)控及其對痛覺敏化的影響,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文細(xì)胞因子及其受體廣泛表示出于免疫細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng),近期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子CCL-2、CX3CL-1、CCL-1等細(xì)胞因子能夠通過激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞引起痛覺過敏。近年來,疼痛的表觀遺傳學(xué)研究逐步深切進(jìn)入。表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列沒有改變的情況下基因表示出發(fā)生可遺傳的改變,華而不實組蛋白乙?；揎検侵匾谋碛^遺傳修飾方式。最新研究發(fā)現(xiàn)組蛋白3賴氨酸9位(H3histonesubunitatlysineresidue9,H3K9)乙?；c疼痛有關(guān)。CCR-8[chemokine(C-Cmotif)receptor8]作為細(xì)胞因子CCL-1的特異性受體,其功能與疼痛調(diào)節(jié)關(guān)系的研究尚未見報道。故本研究擬在小鼠切口痛模型的基礎(chǔ)上,觀察脊髓CCR-8表觀遺傳調(diào)控及其對痛覺敏化的影響。材料與方式方法試劑和儀器七氟醚(批號:11062431),異羥肟酸(Sigma公司,美國),漆樹酸(Sigma公司,美國),抗H3K9(Sigma公司,美國)小鼠一抗、抗CCR-8小鼠一抗(Sigma公司,美國)和堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠二抗(SC-2034,Santa公司,美國),VonFrey纖維絲、Model400熱痛刺激儀(IITC公司,美國)。實驗動物清潔級成年雄性昆明種小鼠64只,體重18~20g,由實驗動物中心提供。所有小鼠實驗前靜養(yǎng)1周,12h/12h晝夜交替,溫度(231)℃,自由進(jìn)食飲水。實驗動物使用遵守實驗動物倫理的相關(guān)規(guī)定。實驗分組64只小鼠隨機均分為:對照組(C組)、切口痛組(INC組)、切口痛+組蛋白去乙?；敢种苿┙M(INC+SAHA組)和切口痛+組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑組(INC+ACA組),華而不實每組10只用于疼痛行為學(xué)檢測,每組另外6只于術(shù)后第4天檢測脊髓H3K9和CCR-8蛋白表示出。小鼠切口痛模型制備小鼠七氟醚吸入麻醉后,碘伏消毒右后爪跖部,參照文獻(xiàn)介紹的方式方法制備切口痛模型:使用手術(shù)刀片從足底近端向足趾方向縱行切開5mm的條形切口,切開足底皮膚后,用眼科鑷提起足底肌肉并縱向鈍性分離,保持其起止附著點完好。切口處紗布壓迫止血,使用6-0尼龍絲線行褥式縫合,手術(shù)后肌注3萬單位青霉素預(yù)防感染。INC+SAHA組和INC+ACA組小鼠分別于術(shù)前1d、術(shù)前2h及術(shù)后連續(xù)1~4d天天上午行為學(xué)測試后腹腔分別注射50mg/kg的SAHA和5mg/kg的ACA,所有藥物劑量和給藥時間以下為參考文獻(xiàn)和預(yù)實驗結(jié)果。小鼠疼痛行為學(xué)記錄術(shù)前1d(T0)、2h(T1)及術(shù)后1d(T2)、2d(T3)、3d(T4)、4d(T5)、5d(T6)、6d(T7)、7d(T8)、14d(T9)小鼠機械縮足閾值(mechani-calwithdrawalthreshold,MWT)和熱縮足潛伏期(pawwithdrawallatency,PWL)。MWT檢測:將有機玻璃箱置于鐵絲網(wǎng)格上,小鼠置于有機玻璃盒預(yù)適應(yīng)30min,以不同力度的VonFrey纖毛刺激大鼠足底,根據(jù)升序的序列從0.2g開場,以纖毛稍稍彎曲作為完全受力標(biāo)準(zhǔn),持續(xù)刺激2s,連續(xù)5次,每次至少間隔15s。若3次不抬腿,換高一級克數(shù)的纖毛;有3次抬腿,則返回低一級克數(shù)的纖毛,直到每5次測試中有3次抬腿。能夠引起3/5次抬腿的最低VonFrey纖毛的克數(shù)計為MWT值。PWL檢測:將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上,小鼠置于有機玻璃盒預(yù)適應(yīng)30min,用熱輻射刺激儀照射小鼠足底,照射開場至小鼠出現(xiàn)抬腿回避終止,熱刺激強度在整個實驗經(jīng)過中維持一致,自動切斷時間為25s,連續(xù)測定5次,每次間隔5分鐘,取后3次平均值計為PWL值。Westernblot檢測小鼠脊髓H3K9和CCR-8蛋白表示出戊巴比妥鈉(30mg/kg)深麻醉下斷頭處死小鼠,冰上操作取L4~L6脊髓腰骶膨大段,以下為參考文獻(xiàn)進(jìn)行Westernblot檢測各組小鼠脊髓H3K9和CCR-8蛋白表示出(H3K9和CCR-8一抗?jié)舛葹?∶500)。所得條帶經(jīng)Photoshop軟件進(jìn)行灰度分析,目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)-actin灰度值之比反響目的蛋白表示出。統(tǒng)計分析采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(珚xs)表示。疼痛行為學(xué)指標(biāo)采用雙因素重復(fù)測量方差分析,組間兩兩比擬采用Bonferronit檢驗,Westernblot數(shù)據(jù)使用單因素方差分析,組間兩兩比擬采用q檢驗。結(jié)果與T0時比擬,T1~T9時C組MWT和PWL比擬差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與C組比擬,T2~T7時INC組MWT明顯降低、PWL明顯縮短(P0.05)。與ICN組比擬,T5~T8時INC+SAHA組MWT明顯降低、PWL明顯縮短(P0.05),T2~T7時INC+ACA組MWT明顯升高、PWL明顯延長(P0.05)(圖1)?！緢D1】與C組比擬,INC組H3K9和CCR-8蛋白表示出明顯增加(P0.05)。與ICN組比擬,INC+SA-HA組H3K9和CCR-8蛋白表示出明顯增加(P0.05);INC+ACA組H3K9和CCR-8蛋白表示出明顯減少(P0.05)(表1)?！颈?】討論外周組織損傷或炎癥產(chǎn)生對傷害性刺激產(chǎn)生過強的反響導(dǎo)致術(shù)后痛覺過敏,嚴(yán)重影響患者的術(shù)后恢復(fù),其機制當(dāng)前仍不特別清楚。研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺敏化經(jīng)過中其重要作用,其通過趨化因子、促炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等及其受體與神經(jīng)元發(fā)生作用,介入痛覺敏化經(jīng)過,華而不實趨化因子在該經(jīng)過的作用正逐步受到重視。CCR-8作為趨化因子CCL-1的特異性受體介入痛覺敏化的發(fā)展,其功能調(diào)節(jié)和痛覺敏化關(guān)系的研究尚不清楚。表觀遺傳學(xué)是指DNA或周圍染色質(zhì)修飾,在不改變DNA序列的情況下影響基因的表示出。組蛋白尾端賴氨酸共價修飾和DNA甲基化是已經(jīng)知道的兩種表觀遺傳調(diào)控形式,這種變化趨勢持續(xù)存在且與細(xì)胞和組織長期適應(yīng)性改變有關(guān)。當(dāng)前,組蛋白乙?；茄芯孔詈媒M蛋白修飾形式,通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histoneacetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙?；?Histonedeacetylases,HDACs)調(diào)節(jié)活性平衡:組蛋白乙?；斐扇旧|(zhì)松弛,轉(zhuǎn)錄活性加強;組蛋白去乙?；斐蒁NA卷曲嚴(yán)密,基因轉(zhuǎn)錄沉默。組蛋白乙?；腿ヒ阴；灰詾樵谏砗筒±項l件下其至關(guān)重要的作用,華而不實包括痛覺敏化經(jīng)過。藥理學(xué)研究顯示,使用HAT或HDAC抑制劑阻斷或刺激組蛋白乙?；捎绊懚喾N疼痛模型的疼痛行為。本研究也發(fā)現(xiàn)使用HDAC抑制劑SAHA使小鼠切口痛模型術(shù)后第4~7天痛覺過敏加強,HAT抑制劑ACA則可緩解小鼠切口痛模型術(shù)后第2~6天痛覺過敏。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腹腔連續(xù)注